实验六酵母蔗糖酶的粗酶制备过程

实验六　酵母蔗糖酶的粗酶制备过程
——研磨水抽提、热处理和乙醇沉淀

【实验目的】

1．提取酵母中的蔗糖酶。

2．了解和掌握酶提取的一般过程和提取过程中的注意事项。

【实验原理】

酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基、二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶中每个亚基比内酶多两个氨基酸，即Ser和Met。此外它们的分子量也不同，外酶约为270kU(或220kU，与酵母的来源有关)，内酶约为13．5kU。但是两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，因此本实验中提取得到的大多为外酶。

本实验采用研磨水抽提、热处理和乙醇沉淀，提取获得蔗糖酶的粗酶制品，为接下来的实验做准备。

【实验器材】

研钵1个、50 ml离心管3个、滴管3个、50 ml量筒、恒温水浴锅1个、100 ml烧杯2个、广泛pH试纸、高速冷冻离心机等。

【药品试剂】

酵母、二氧化硅、去离子水(使用前预冷)、碎冰、1 mol/L乙酸、95%乙醇。

【实验方法】

1．用研磨水抽提方法获得蔗糖酶的粗酶提取物(级分I)

(1)取10 g酵母，加5 g二氧化硅一起放在研钵中。

(2)缓慢加入预冷的30 ml去离子水，每次加5 ml。边加边研磨，至少研磨30分钟。

(3)将研磨后的混合物转入离心管中，平衡后离心15分钟(4℃，10000 r/min)。

(4)将上清液转移到另一个50 ml离心管中，再次以同样条件离心。

(5)将上清液转入另一支50 ml离心管中，测定pH值，用1 mol/ L乙酸将pH值调节到5。留出1．5 ml该粗酶提取液，标记为“级分Ⅰ”(用于测定活力和蛋白质含量，并计算此时的比活力)。

2．热处理和乙醇沉淀(级分Ⅱ)

(1)将上述离心管中的样品在50℃水浴锅中加热30分钟，并在保温过程中不断地轻摇离心管。

(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃，10000 r/min，离心10分钟。

(3)将上清液转到量筒中测量体积，再转入小烧杯中(取出1．5 ml到EP管中，标记为级分Ⅱ)，放到冰浴中，缓慢加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌，再在冰浴中放置10分钟。于4℃，10000 r/min，离心10分钟，倾去上清液，滴干后，将沉淀保存在－20℃。

【思考题】

1．蔗糖酶提取过程中为什么可以进行热处理?

2．乙醇沉淀蔗糖酶的原理是什么?