酶标记物的制备

一、酶标记物的制备

（一）常用酶及其底物

1.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）及其底物　HRP是应用最为广泛的标记用酶，自植物辣根中提取，其催化的底物为H₂O₂和供氢体。反应过程中H₂O₂为受氢体，许多化合物可作为HRP的供氢体，在ELISA中常用的供氢体为邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB）。OPD作为底物，灵敏度高，比色方便。但是其具有致癌性，稳定性差，需新鲜配制后1 h内使用，显色过程要避光。TMB则更为稳定安全，而且经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，成色反应无需避光，因此TMB是ELISA中应用最广泛的底物。

2.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）及其底物　AP从大肠杆菌中提取，常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP），产物为黄色的对硝基酚。在ELISA应用时，其敏感性高于HRP，空白值也较低。但AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，国内在ELISA中一般采用HRP。两种酶的底物及其特点见表6-2。

表6-2　辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶底物特点

（二）酶标记抗体（或抗原）的制备

酶标记的抗原或抗体称为酶结合物或酶标记物。用于制备酶结合物的抗原要求纯度高，特异性强；而抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强。易于分离纯化和批量生产。

1.常用的标记方法

（1）戊二醛交联法　戊二醛是一种双功能交联剂，可以通过两个活性醛基，分别与酶和抗原（或抗体）的氨基结合，从而将两个分子偶联起来。

（2）过碘酸盐氧化法　本法只用于HRP的标记。HRP含18％的碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基，而不影响其酶活性。酶上的醛基很活泼，可与抗原（抗体）结合，形成酶标结合物。

2.酶标记物的纯化与鉴定　按以上方法制备的结合物，需去除未结合的酶、抗原（或抗体）、酶聚合物以及抗原（抗体）聚合物，以避免游离酶增加非特异性显色反应和游离抗原（或抗体）的竞争作用，需予以纯化。纯化的方法较多，常用的有饱和硫酸铵盐析法和葡聚糖凝胶过滤法。

每批制备的酶标记物都要进行免疫活性鉴定和酶标记率测定，前者常用的技术为免疫电泳或双向免疫扩散，后者则采用分光光度计技术。