鲜切花组织培养

【任务引入】

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。

图5－1　鲜切花组织培养

【任务目标】

能力目标：

★会正确选择外植体，会进行培养基配制和灭菌。

★能正确进行接种与培养，能进行组培苗的驯化和移植。

知识目标：

▲掌握组织培养苗的特点。

▲掌握组织培养原理

▲了解污染产生的原因和控制方法。

【相关知识】

组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，接种到人工配制的培养基上培养，使其产生完整植株的过程。

在组织培养中，用来做培养材料的植物离体器官、组织、细胞或原生质体等，称为外植体。

组织培养特点：节省材料、生长周期短、繁殖速度快、后代整齐一致、无病毒、管理方便。

1.组织培养的原理

植物细胞的全能性是组织培养的理论基础，细胞全能性是指植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。

脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。外植体细胞脱分化分裂的结果是形成愈伤组织。

再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。

愈伤组织是指在组织培养中产生的，由薄壁细胞构成的无组织结构的细胞团。

尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、组织和细胞的不同而异。

2.组织培养的程序

（1）配制培养基质

1）培养基的成分

培养基的成分主要包括无机盐类（分大量元素和微量元素）、有机物质（维生素等）、生长调节物质以及碳源等4大类。

①无机盐类。植物所需的10大元素，除碳、氢、氧由水和空气中供给外，其他氮、磷、钾、硫、钙、镁、铁等7种均需加到培养基中；微量元素有硼、锰、锌、钼、钴、碘、铜等。

②有机物质。主要是维生素B1、B2、烟酸和肌醇等。

2）培养基的配制

选定培养基以后，需把大量元素、微量元素、有机物都配成母液，扩大倍数为稀释液，贮存备用。使用时，根据所需配制的量，在稀释液中加一些肌醇、水解酪蛋白、蔗糖等，再加铁盐［需用乙二胺四乙酸二钠（Na2－EDTA）加硫酸亚铁配制成螫合铁］配制成营养液，然后吸取需用量，加入培养基中，再测其酸碱度（一般pH值在5.5～6.5之间即可），最后加琼脂煮沸后分装入三角瓶或试管中，封口待用。

（2）消毒灭菌

消毒灭菌非常重要，关系到组织培养的成败。污染的途径是器皿、用具、材料的带菌，以及接种室的空气、墙壁、地板等的不清洁，故必须针对所提及的几方面，进行严密的消毒灭菌。

1）培养基消毒

将配制分装好培养基的三角瓶或其他容器放入高压灭菌锅中，在15磅／平方英寸的压力下，经20分钟高压灭菌即可。

2）器皿与用具的消毒

接种用具及玻璃器皿、洗涤材料用的无菌水，用牛皮纸包好后和培养基一起放在高压灭菌锅中消毒灭菌。

3）接种室消毒

接种室的地面及墙壁，在接种前后均要用1∶50的新洁尔敏湿性消毒，每次接种前还要用紫外线灯照射消毒30～60分钟，并用70%的酒精在室内喷雾，以净化空气，最后是超净台台面消毒，可用新洁尔敏擦抹及70%酒精消毒。

（3）选取植物材料（外植体的选择）

可以选取生长健壮、无病虫害、能保证原品种优良性状的植物体的任何部位，如茎尖、茎段、叶片等，还可根据需要，采用根、花瓣、鳞茎、花粉、花药等部位来培养。

（4）外植体处理及消毒

取得材料后，需先清理，去掉多余部分，然后冲洗、洗涤剂洗涤、漂清后放入接种室或超净台上，用70%的酒精浸泡半分钟，进行表面消毒，再在10%的漂白粉溶液中消毒10分钟左右，取出后用无菌水冲洗4～5次，即可接种。一般材料的选择以幼嫩部分为好。草花用嫩茎、花托为好；球根花卉用茎顶、鳞茎盘、鳞叶等为好。

（5）接　种

接种用的钳子、解剖刀、接种针等均需在火焰上消毒后用，用后再消毒。将消毒好的材料置于培养皿中，用解剖刀切去其边缘，再切成小块接种在培养基上，使组织块与培养基密合，不得将材料陷于培养基中，接好后随即将瓶口封好待培养。

（6）培　养

接种完毕后即可置于培养室，在恒温、加光条件下进行培养，培养一段时间后，根据情况将材料从诱导愈伤组织的培养基转到分化培养基（也有只用一种培养基就可直接诱导分化成绿苗的），最后转移到生根培养基上。

（7）试管苗移栽

试管苗发根后，必须随即转移到栽培基质中去，这种基质可以用培养土、蛭石、珍珠岩等配成。将试管苗从瓶中揪出，洗去残存的培养基，移植到准备好的基质中去，随即用细喷壶喷水后加玻璃或塑料罩，3～4日内不必浇水，以后浇些清水，1周后见苗已挺直，可去罩浇培养液（以过去所用培养基的大量及微量元素减半配成），以利生长，2～4周后可进行常规栽培。

【任务实施】

材料和用具

1.材料：外植体材料、蒸馏水、绑扎绳、药品封口膜、培养基、70%的酒精溶液、0.1%升汞溶液。

2.用具：

室内仪器：高压灭菌锅、水浴锅、解剖刀、三角烧瓶、酒精灯、烧杯、量筒、培养皿、棉线、接种箱、分析天平、长镊子、剪刀、容量瓶、移液管、牛皮纸等。

室外设备：育苗温室、遮阴棚等。

操作步骤

图5－2　花卉组织培养流程

1.培养基制备与灭菌

根据培养基的成分与用量，准确称取各种母液。然后加热溶解琼脂、蔗糖等，再将母液加入容器内并搅拌均匀，定容。调整pH值，并装瓶封口。然后放入高压锅内灭菌，在121℃条件下稳压20分钟。

2.外植体选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，经过适当的预处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药。

3.无菌接种与培养

对接种室、工作台面进行灭菌后，按无菌操作程序将外植体接种到初代培养基上。

4.初代培养

接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。

5.继代培养

分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。

6.生根培养

刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进小苗生根，提高其健壮度。

7.炼苗移栽

选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮阴，防止病虫危害。当组培苗完全成活并生长一定大小后，即可移向大田用于生产。

【知识拓展】

主要鲜切花组培运用

鲜切花的运用上，以满天星、香石竹、情人草、月季、非洲菊、勿忘我、菊花、洋桔梗等比较成功，作为主要流行切花种类，种苗的90%以上是组培苗或以组培苗为母本的扦插苗，洋桔梗在有制种技术的前提下，也可采用籽播苗，但与组培苗相比，在长势和产量等方面，仍有一定的差距。以云南的种苗市场为例，香石竹的需求量最大，它可用脱毒原种进行扦插，也可直接组培快繁生产种苗，其次是满天星，每年的种苗需求量达近千万株，均为组培苗，再次是月季，最近几年来，非洲菊、情人草、勿忘我的组培苗需求量迅速增加，年需量达到200万株左右，洋桔梗的种植量也在逐年增加。主要生产企业有云南农科院园艺所、植保所、云南铁路花卉、上海良种场、上海大地园艺种苗有限公司、中国农科院花卉所、通海种子公司等单位，它们多数为依托科研机构的实体，有科研开发创新的技术基础。