心肌细胞骨架是细胞内由微管、微丝及中间纤维结蛋白构成的骨架系统，该细胞骨架和心肌收缩蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白一起构成了心肌的收缩单位。大鼠成心肌细胞是从大鼠胚胎心脏组织克隆得到的。它具有与原代培养乳鼠心肌细胞相似的功能特性，易于分离培养，并可传代。随着对心血管疾病的日益重视和研究的深入，大鼠成心肌细胞越来越多地应用在需要模拟在体缺血、缺氧、高糖等环境下及信号转导通路等的研究领域里。细胞骨架在细胞间传递机械、物理和化学因子的信号，并在这些机械理化因子刺激下细胞骨架会发生相应的变化，因此有必要对正常生理情况下大鼠成心肌细胞的细胞骨架进行研究。原子力声显微镜是将声学检测技术与原子力声显微镜结合，可对细胞表面及内部结构进行纳米量级的显微分析，提供反应细胞表面及亚表面结构的形貌像及声学像。
笔者应用原子力显微镜研究正常生理情况下的大鼠成心肌细胞的细胞骨架图像特点。采用大鼠成心肌细胞，应用Veeco DI 3100型原子力声显微镜，探针型号：DNP-10，具体参数：k=0.1134N/M，f=22.26kHz。从H9C2细胞形貌图中可以看到细胞在盖玻片表面呈梭形伸展，细胞或单个，或彼此之间以纤维状物相连接。成心肌细胞的细胞表面高低不平，细胞核区域位于细胞中心，可见胞核的部分区域亮度略较胞质增强、呈不均匀分布，核仁区域图像较亮，胞核周围明显转暗（低平）。
在大鼠成心肌细胞的核外胞质中，可清晰显示网状结构的细胞骨架结构（图14-2）：微管呈较粗较亮的短线状结构，在距核较远处可见成束的中等亮度的微丝结构；致密斑靠近细胞膜的内面，为片状较亮的光斑，微丝附着其上；可见致密斑、致密体和中间丝。致密斑靠近胞膜的内面，可见肌丝附着。致密体位于胞质内，位置较深，硬度较高，为梭形小体，是细肌丝和中间丝的共同附着点。相邻的致密体之间由中间丝相连，构成成心肌细胞的菱形骨架，在细胞内起着支架作用。成心肌细胞的高度为500nm。
图14-2 原子力声显微镜显示大鼠成心肌细胞骨架结构的网状结构
A——胞核；B——胞质。
可以看到中心为突出的胞核区域，胞核膜基质面不光整，附有多个大小不等的高回声颗粒，该颗粒可能为核糖体。胞核膜连续性不完整，可见多处有连续中断，为核孔。核内染色质分布不均，在形貌像中亮度较大或中等亮。
心肌细胞的骨架系统具有支持作用，对维持细胞的形态与生理功能起着关键性作用。细胞骨架在细胞间传递机械和理化等因子刺激，它们通过锚定亚细胞结构，如线粒体、高尔基体、胞核、肌丝等而对细胞的稳定性起重要作用。细胞骨架的变形与收缩功能也影响了细胞的迁移、分化、凋亡及增生。通常，由肌球蛋白马达使细胞骨架处于预应力状态下，并通过肌动蛋白细胞骨架，获得微丝结构上的张力平衡，还有小部分预应力被微管结构中的压缩力所平衡。细胞骨架中的预应力不仅维持细胞形状和力学稳定性，而且对于维持细胞的生物功能也很重要。
通过膜相关蛋白，特别如同时与细胞内肌动蛋白和细胞外层粘连蛋白结合成为肌细胞增强蛋白，可以起到稳定和机械传递的作用。胞外基质通过整联蛋白可以改变骨架的组成等性状。实际上，骨架可能调节细胞表面的状况及信号从胞外向胞内的传递，也参与胞核的重要工作如转录。当心脏功能处于代偿阶段，微管的数量可在正常范围。出现心力衰竭时，微管的数目显著增多，而且微管的排列异常，因此降低了微管对细胞的支持作用。另外，还有文献提出，心肌骨架系统损坏也可能是心肌缺血再灌流损伤的原因之一。
大鼠成心肌细胞是同时具有骨骼肌与心肌功能的特异心肌细胞株系，其细胞骨架主要由微管、中间丝和微丝及相关的骨架蛋白组成。它不仅作为细胞的支架，同时也参与细胞的一系列生理活动。
原子力显微镜不仅能对比不同细胞的表面颗粒等超微结构的分布和排列情况，还可以通过计算细胞表面数据点的均方根和平均值进行定量统计其粗糙度和黏附力的大小。AFM能观察到细胞内的骨架结构，一种观点认为可能是当探针扫过亚细胞结构的胞质膜（质膜）时，胞质膜本身发生变形、起皱，从而显示出亚细胞的轮廓，或者因探针插入胞质膜而直接显示亚细胞骨架结构。另外一种观点则认为是在细胞边缘的胞质较薄，因而探针能对亚细胞骨架直接成像，不过确切的机制仍不清楚；但免疫化学及细胞松弛素B实验证实用原子力声显微镜观察到的纤维就是肌动蛋白纤维。原子力显微镜加声激励方法即原子力声显微镜清晰显示胞膜、胞质、细胞骨架、胞核、细胞之间连接形态结构及其弹性特征。
通过用原子力声显微镜观察正常生理情况下的大鼠成心肌细胞，从成骨骼肌细胞表面像图中可以清楚地看到细胞在盖玻片表面呈梭形伸展，细胞或单个，或彼此之间以纤维状物相连接；细胞表面及胞核的结构。在大鼠成心肌细胞的核外胞质中，还可以清晰显示网状结构的细胞骨架结构（其微管呈较粗较亮的短线状结构，在距核较远处可见成束的中等亮度的微丝结构；致密斑靠近胞膜的内面，为片状较亮的光斑，微丝附着其上）。可见致密斑、致密体和中间丝。致密斑靠近胞膜的内面，可见肌丝附着。致密体位于胞质内，位置较深，硬度较高，为梭形小体，是细肌丝和中间丝的共同附着点。相邻的致密体之间由中间丝相连，构成成心肌细胞的菱形骨架，在细胞内起着支架作用。
肌丝密切相关的细胞骨架蛋白及其相关蛋白的微妙变化可能是肌丝功能异常的重要原因。今后，肌丝、细胞骨架蛋白及其相关微观结构的变化可能会成为心肌缺血损伤的评价标准。目前测定大鼠成心肌细胞超微结构的方法多为电子显微镜和激光共聚焦显微镜。电子显微镜中样本必须在真空中观察，因此无法观察活样本，且样本制备过程复杂，还要把细胞切割成多个薄片，难以观察整个细胞的完整细胞骨架结构。激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，把光学成像的分辨率提高了30%～40%。有研究发现，激光共聚焦显微镜观察到心肌缺血期各种细胞骨架和收缩蛋白均发生改变，条纹状分布的黏着斑蛋白逐渐变为环状分布，但激光共聚焦显微镜观察需事先荧光染色，过程繁琐。临床对生理状态大鼠成心肌细胞的超微形态学特点了解甚少，AFAM在观察细胞表面超微结构、细胞骨架以及细胞的力学特性和生物过程中发挥着极其重要的作用，随着AFAM技术的不断完善，AFAM在提高生物软样品的成像率、实现细胞上及生化反应动态过程中细胞超微结构的实时识别等方面将会得到更大的发展。这将为阐明疾病的发病机制、筛选药物靶向位点、疾病诊断和制定治疗策略提供更丰富的研究资料。
（张宇辉 金佳美）
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