脂质体制备的关键问题

第三节　脂质体制备的关键问题

脂质体的制备涉及3个最为关键的步骤，就是磷脂的水化、粒度的控制以及药物的装载。磷脂水化是磷脂分子与水分子接触，分子间发生重新排列定向，并形成磷脂双分子层的过程。得到的磷脂双分子层由于热力学的原因，在合适的条件下会闭合形成脂质体。控制磷脂的水化条件是非常重要的。通常要求磷脂的水化在磷脂的相转变温度之上完成。不同的磷脂其相转变温度是不同的。天然的磷脂T_c值通常在零度左右，而饱和的磷脂如DSPC，其T_c则在55℃左右。要根据磷脂的不同选择合适的水化温度。当处方中有几种磷脂分子时，水化温度应以最高的相转变温度为准。磷脂水化时，缓冲盐的种类、浓度以及pH值也是必须认真考虑的因素。磷脂水化后在磷脂的头部会同时形成水化层和电离层。缓冲液中的离子种类、浓度以及pH会对磷脂头部的电离层产生显著的影响，进而影响脂质体的荷电行为和整个体系的稳定性，因此是必须认真考虑的问题。

脂质体粒度的控制也是一个非常重要的问题。最终产品的粒度会显著影响其体内行为，进而影响被包封的药物的治疗效果和毒性。最终产品的粒度控制在什么范围，与产品的治疗目的有关，如将脂质体用作药物储库，发挥其缓控释作用，可以将脂质体的粒度控制在微米级。如希望脂质体作为抗肿瘤药物的载体，通常需要将脂质体的粒度控制在100 nm左右。通过临床前的药理学和毒理学研究，可以选择出最佳的粒度范围。但是为了使最终产品的粒度在需要的范围内，必须使用合适的制备工艺和制备设备。不同的制备工艺得到的脂质体的粒度是不同的。例如采用叔丁醇冷冻干燥再水化的方法制备脂质体，其粒度可能在微米级。而在磷脂浓度较低的情况下，使用乙醇注入法制备脂质体，绝大多数的脂质体为小单室脂质体。同样，降低粒度的设备也有多种，如加压挤出、微射流等，不同的设备获得的最终产品的粒度和分布不尽相同，必须根据自己的需要，合理选择。

药物的装载更是一个非常重要的问题。必须选择合适的制备方法和处方，以便获得较高包封效率和载药量。同时要确保在贮存期内药物可以有效在脂质体中滞留，不至于渗漏出来。通常，对于一个纯粹的水溶性药物，使用二次乳化法，可能是一个比较好的选择。而对于脂溶性药物，一般的被动载药手段都可以得到较高的包封效率。但是载药量对于某些药物可能受到限制。两亲性药物，如果性质合适，可以考虑使用主动载药模式。必须根据药物的性质和期望的治疗目的，使用合适的载药手段。

脂质体的制备在很大程度上就是解决上述3个问题。但是其他一些问题，诸如溶剂的残留、如何获得无菌制剂、实验室的制备工艺能否有效地放大等，都是不可忽视的问题。

一、制备过程的常见问题及其对策

如前所述，制备脂质体的工艺非常多。不同的制备工艺，影响产品最终质量的因素是不同的。在这里仅给出一些常见的共性问题。

1．关于脂质体的形成

脂质体的形成涉及磷脂的水化，形成磷脂双分子层，以及双分子层卷曲闭合等诸多过程。不同的脂质体制备过程，其脂质体形成的机制不尽相同。例如采用二次乳化法制备脂质体时，脂质体的形成发生在有机溶剂挥发的过程中，已经水化的磷脂单层之间相互聚集，从而形成脂质体。而在薄膜分散法中，干燥的磷脂膜之间已经发生了有规律的重排。加入水后，有序的磷脂层从壁上脱离从而卷曲形成脂质体。但是无论是哪种制备方法，磷脂的水化都是非常重要的步骤，因此控制合适的水化条件是必需的。水化必须在磷脂的相转变温度之上进行。如果磷脂水化不充分，就会导致最终产品的粒度不均匀，甚至有磷脂沉淀，严重影响产品的质量。

2．有机溶剂的残留

制备脂质体的过程中，几乎不可避免地要使用有机溶剂。除了乙醇以外，几乎所有的溶剂都是对机体有害的溶剂;因此制备的产品无论是用于动物实验还是用于临床研究，对有机溶剂的残留量应该予以控制。此外，残留的有机溶剂也可能影响到磷脂的聚集状态。例如，如果体系中残留较大量的氯仿，那么获得的产品中就有可能存在乳滴。严格地控制有机溶剂的残留量是必需的。

3．缓冲液的使用

在制备脂质体的过程中，必须选择合适的缓冲体系。这对于主动载药技术，尤其重要。例如在使用pH值梯度法载药时，只有使用合适的内外缓冲液组合，药物才能够有效地在脂质体内滞留。即使对于被动载药制备的脂质体，选择合适的缓冲体系也是非常重要的。过大的离子强度以及不合适的离子种类会诱使脂质体发生聚集融合。而过低的离子强度可能起不到良好的缓冲作用，同时也有可能导致某些种类的磷脂无法有效地水化，形成稳定的脂质体。

4．制备方法的选择

要求研究者根据需要进行合理的选择。选择合适的制备方法才能保证获得稳定的具有合适包封效率和载药量的脂质体制剂。如使用二次乳化法，可以有效地包封水溶性药物。而将膜蛋白重建在脂质体上，则宜使用去污剂透析法。

5．粒度的控制

脂质体可以分为大单室脂质体、多室脂质体以及小单室脂质体等，但是当脂质体的粒度太小时(20～30 nm)，由于曲率方面的原因，内层的磷脂头过于拥挤，此时脂质体是不稳定的。因此在制备脂质体时，不要超过上述限度。此外，在冷冻干燥脂质体时，对其粒度也有要求，应该控制在50～150 nm，此时冻干的效果较好。

二、制备过程中的稳定性

制备过程中的稳定性，涉及磷脂类辅料、药物以及得到的脂质体的稳定。天然来源的磷脂主要为蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂。这两种磷脂的脂肪酸链上由于含有不饱和双键，容易氧化。因此在制备的过程中添加脂溶性抗氧化剂，如维生素E或者其酯衍生物通常是必需的。有时为了进一步降低磷脂氧化的可能性，甚至要求在水相中添加水溶性抗氧化剂或者2价离子螯合剂。同时，无论是天然来源的磷脂，还是人工合成的饱和磷脂，都有可能在制备的过程中发生水解。磷脂可以在分子内的4个部位发生水解，其中两条酰基链的水解尤其值得关注。磷脂水解掉一条酰基链后，就会形成溶血磷脂。溶血磷脂作为表面活性分子，如果在脂质体中的含量超过一定的比例，就会导致脂质体解体。同时溶血磷脂本身由于可以破坏磷脂膜，对机体的细胞可能也有毒害作用。因此要求严格的监控磷脂水解的程度。通常，磷脂分子在pH6．5左右最为稳定，如果pH偏酸或者偏碱，或者温度升高，磷脂的水解常数都会增加。磷脂水解问题在使用pH值梯度法载药时，尤其值得重视。因为使用上述方法时，通常在加热的情况下载药，而此时脂质体的内相多为偏酸性环境，因此容易引起磷脂的水解。所以应该通过处方设计合理的控制工艺条件。

药物的稳定性也是制备工艺中应该予以考虑的问题。由于脂质体的制备工艺通常比较复杂，有时需要使用有机溶剂、低pH值和较高的温度，这对于蛋白质多肽类药物的装载，尤其是一个考验。为了有效地防止蛋白质类药物变性，可以在制备的过程中使用被动载药方法，即在低温水化磷脂粉末的同时，被动包封蛋白类药物。某些特殊的药物，如蒽环类类抗生素，由于比较容易氧化，可以在水相和脂相中同时添加抗氧化剂。

脂质体的稳定性也是重要的问题。作为热力学不稳定体系，脂质体之间很容易发生聚集，甚至融合等现象。为了保证脂质体的稳定性，可以采取多种手段。如合理地选择缓冲液的种类，在处方中加入长循环脂类或者荷负电的磷脂，以及有效的控制脂质体的粒度等。但是通常处方的改变会引起脂质体在体内行为的变化，因此应该根据需要进行合理的设计。

三、大规模制备中的关键问题

对于脂质体的工业化大生产，涉及很多方面的问题。例如脂质体制剂的粒度和分布显著影响其体内的行为，这就要求大生产时使用的控制粒度的设备，批与批之间具有很好的重现性。通常控制粒度的手段有高压挤出，微射流和高压均质等手段。不同的设备，不同的工艺参数获得的产品的粒度和分布是不同的，应该合理选择。

成功地将实验室的小规模试制放大到工业规模生产也是一个重要的问题。脂质体的实验室制备工艺有很多种，但是绝大多数都不能应用于工业化生产。在开始研发的时候，选择合适的起始工艺是必要的。要尽可能地保证使用的工艺可以有效地放大。尤为重要的是要解决有机溶剂残留的问题。实验室制备时，由于试样体积小，可以很有效地除去有机溶剂，但是在产业化制备的过程中可能会出现问题。

大规模制备的产品，通常是为临床应用准备的，这就要求最终的产品要避免受到细菌或热原的污染。而作为热力学不稳定的分散系，脂质体制剂是无法加热灭菌的。这就要求严格的控制整个生产流程，保证整个生产过程在无菌的封闭体系内完成。或者最终的产品能够过滤除菌，其他步骤在控制区或洁净区内完成。