染色体显带技术

第二节　染色体G显带技术

染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构。自20世纪60年代末以来，染色体显带技术得到了很大的发展。这一技术的应用，可以准确识别23对不同类型的染色体，并能识别同一号染色体上的不同区带，从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了更有效的手段。

显带染色体是染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的带纹，称为染色体带，这种染色体显带的技术，称为显带技术。通过显带技术，使各号染色体都显现出独特的带纹，这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型不同。20世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，在众多的显带（Q带、G带、C带、R带、T带）技术中，G带是目前应用最广泛的一种带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术。因其方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，而被广泛用于染色体病的诊断和研究。一套单倍体染色体带纹数有320条带。70年代后期，由于技术的改进，可以从早中期、前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显示550～850条或更多的带纹，称为高分辨显带染色体（high resolution banding chromosome，HRBC）。

一、显色原理

关于G带的形成机制，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰蛋白酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这些区域呈现出浅染（浅带）。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染（深带）。还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上T—A和C—G碱基的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。A—T碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而G—C碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。总之，目前说法较多，主要概括为3种观点，即显带是由于：①DNA的作用；②蛋白质的作用；③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。

G显带制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观察，已成为研究分析染色体的主要常规方法之一。

二、实验用品和材料

（一）器械

普通光学显微镜、37℃恒温水浴箱、立式染色缸、刻度吸管、橡皮吸头、pH试纸。

（二）试剂

2．5%胰蛋白酶原液、0．25%的胰蛋白酶工作液、生理盐水、Giemsa原液、Giemsa工作液、1mol/L磷酸缓冲液（pH 4．0～4．5）。

三、基本步骤（胰蛋白酶法）

1．将常规制备的人染色体玻片标本（未染色的白片）置于70℃烤箱中处理2h，然后转入37℃培养箱中备用，一般在第3～7天进行显带。

2．取0．25%胰蛋白酶溶液5ml，倒入染色缸中，加入45ml生理盐水，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH及酚红调节胰蛋白酶溶液pH 6．8～7．2。

3．将配好的胰蛋白酶工作液放入37℃恒温水浴箱中预温。

4．将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理1～2min（精确的时间需自行摸索）。

5．立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗2次。

6．将标本浸入37℃预温的Giemsa工作液（Giemsa原液和pH 6．8的磷酸缓冲液比例为1∶9）中染色10min左右。

7．自来水冲洗（用细水小心冲洗），空气晾干。

8．镜检显带效果：在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂象，转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。

四、G显带核型分析

准备G显带中期分裂象照片一张，将各条染色体逐一剪下，根据其大小、带型特点和着丝粒位置，依次分组、配对和排列组合，待检查无误后，贴在报告纸上，写出核型的简式（繁式）。

五、注意事项

1．良好的培养效果为：标本片上中期分裂象要多，且染色体分散要好。

2．胰蛋白酶溶液需在使用前新配制。

3．染色体长度应能适应显带分析技术的要求。

4．烤片时间也很重要。

5．G显带成败之关键取决于胰蛋白酶液的浓度和处理时间之搭配，故每次进行染色体G显带时，最好先试做一张制片，摸索胰蛋白酶处理时间，以保证获得最好的染色体G显带标本。