实验13 双向琼脂扩散实验
(Double agar diffusion test)
【目的】
掌握双向扩散的基本原理、方法、结果分析及临床用途。
【原理】
可溶性抗原与抗体分子均可在琼脂凝胶中移动扩散，若两者相对应，则可在抗原和抗体比例合适的位置上形成白色沉淀线，一对抗原-抗体系统一般只能形成一条沉淀线，不同的抗原和抗体在琼脂中扩散的速度不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。本实验为定性试验，可用来检测抗原和抗体是否相应，测定免疫血清纯度，以及分析和鉴定某些复杂的抗原成分或免疫血清效价测定。
【材料】
1.巴比妥缓冲液(离子强度为0.05，pH8.6)。
2. 1％巴比妥琼脂。
3.人血清。
4.兔抗人IgG抗体。
【方法】
1.吸取加热融化的1％巴比妥琼脂若干毫升浇于放置水平台面上的玻璃板上制成均匀的琼脂板，厚度为2mm。
2.用内径3mm打孔器按图13-1打孔。
3.加入人血清于小孔内。
4.将琼脂板置电泳糟内进行电泳，按电压4～6V/cm，电流2～4mA/cm的条件下电泳1～2.5h，电泳完毕，用小刀在琼脂板中央挖一小槽，槽长60mm，槽宽1mm，孔槽距离5mm，在槽中加入适量抗人血清抗体。
5.将琼脂板放入湿盒中，置室温内扩散1～3天。
6.直接观察结果或染色后观察结果如图13-1所示。
图13-1 双向扩散结果示意图
【结果】
待测标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线吻合，则为阳性反应。如无沉淀线出现或是与阳性对照沉淀线交叉的沉淀线则为阴性(图13-1)。
【注意事项】
1.浇板时，琼脂面要铺平、无气泡;浇好后要放置2min凝固。
2.加样时避免样品溢出孔外。
3.加样时，注意不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。
4.反应时间要适宜。时间过长，沉淀线可解离至假阴性;时间过短，则沉淀线不出现。
5.加样时抗体、阳性血清及待测标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。
【思考题】
双向扩散的基本原理是什么?
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