抗原或抗体的体外试验

第一节　抗原或抗体的体外试验

抗原与相应抗体可在体外一定条件下发生特异性结合，并可出现各种肉眼可见或借助仪器可检测的反应现象。因抗原抗体的结合具有高度特异性，所以可对样品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位的检测。可用已知的抗原检测未知的抗体，以诊断疾病；也可用已知的抗体检测未知的抗原，用以鉴定抗原。在进行体外抗原抗体反应时，以往多采用人或动物血清作为抗体的来源，故体外的抗原抗体反应也称血清学反应或血清学试验。

一、抗原抗体反应的特点

1．特异性　抗原借助其决定簇与相应抗体的可变区在空间构型上的互补关系依靠两分子间的静电引力、氢键结合力、疏水作用力等，而发生特异性结合。空间构型互补程度越高，抗原决定簇与抗体可变区间结合力越强，抗原抗体的特异性越强，亲和力也越高。

2．可逆性　抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下可发生解离，恢复抗原抗体的游离状态。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，在低pH值、高盐情况下可导致复合物解离。

3．可见性　抗原抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例是否适当。若比例合适，抗原抗体结合后形成大的复合物，出现肉眼可见反应；若抗原过剩或抗体过剩，抗原抗体结合后形成小的复合物，则不可见。

4．阶段性　抗原抗体反应可分为两个阶段，第1个阶段是抗原抗体特异性结合阶段，其特点是反应快，可在数秒至几分钟内完成，一般不能为肉眼所见；第2个阶段是反应可见阶段，根据参加反应的抗原物理性状的不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象，所需时间较长，从数分钟至数小时不等。

二、影响抗原抗体反应的因素

1．电解质　抗原抗体通常为蛋白质分子，在中性或弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。

2．酸碱度　抗原抗体反应的最适pH在6～8之间，pH值过高或过低，均可直接影响抗原、抗体的理化性质。当抗原抗体反应液的pH接近抗原或抗体的等电点时，抗原或抗体所带正负电荷相等，由于抗原或抗体自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应，即假阳性反应。

3．温度　适当的温度可增加抗原与抗体分子相互碰撞的机会，加快二者结合速度，在一定范围内，温度越高，形成可见反应的速度越快。但温度过高（56℃以上），可使抗原或抗体变性失活，影响实验结果。通常37℃是抗原抗体反应的最适温度。

三、常见的抗原抗体反应类型

抗原抗体反应种类繁多，基本类型有凝集反应、沉淀反应、补体结合反应及中和反应。近年来在上述反应的基础上发展了免疫标记技术，使抗原抗体反应的敏感度显著提高，已广泛应用到医学和生物学等许多领域中。

（一）凝集反应

颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应（agglutination）。

1．直接凝集反应　颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集现象。主要有玻片法和试管法两种。①玻片法：是一种定性试验，多用已知抗体检测未知抗原，此法简便快速，常用于细菌的鉴定和分型、人类ABO血型测定等。②试管法：为半定量试验，多用已知抗原测定受检血清中某种抗体的相对含量，受检血清用生理盐水作倍比稀释，再加入等量的已知抗原，血清最高稀释度仍出现明显凝集者为血清效价。血清效价越高，说明该受检血清中抗体含量越多。如诊断伤寒的肥达反应即属此种试验。

2．间接凝集反应　将可溶性抗原先吸附于一种与免疫无关的颗粒状载体表面，成为致敏颗粒，再与相应抗体结合出现的凝集现象称为间接凝集反应。常用的载体颗粒有红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒为红细胞，称为间接血凝试验；如是乳胶颗粒，称为间接乳胶凝集试验。如果是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，检测未知抗原则称为反向间接凝集试验。

如果先将可溶性抗原与相应抗体混合，两者反应后再加入已知抗原致敏的载体颗粒，因抗体已与抗原结合，载体颗粒不再出现凝集现象，这种反应称为间接凝集抑制试验（图13－1）。此法可用于检测早期妊娠孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的妊娠试验。

图13－1　间接凝集和间接凝集抑制试验原理

3．协同凝集试验　是利用葡萄球菌为载体的反向间接凝集试验。葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段发生非特异性结合，结合后的IgG的Fab段仍保持与相应抗原结合的能力。当结合在SPA上的IgG与抗原结合时可使葡萄球菌发生凝集。可用于检测体液中的微量可溶性抗原，用于流脑、伤寒、布鲁菌病等的早期诊断。

（二）沉淀反应

可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、病毒抗原等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的沉淀物称为沉淀反应（precipitation）。沉淀反应方法很多，如环状法、絮状法、琼脂扩散试验及免疫浊度法等，目前后两种方法较常用。

1．琼脂扩散试验　是在琼脂反应板中进行的一种沉淀反应。即抗原与抗体在半固体琼脂凝胶中扩散并相遇，在两者比例合适处结合形成可见的白色沉淀。

（1）单向琼脂扩散试验　将特异性抗体均匀混合于溶化的琼脂中，然后浇制成琼脂板，再按一定要求打孔并在孔中加入抗原，使抗原向孔周围自由扩散，与琼脂中的抗体结合形成免疫复合物并沉积下来，形成沉淀环，根据沉淀环直径可定量检测抗原含量（图13－2）。主要用于各类免疫球蛋白和补体各成分含量的测定。

图13－2　单向琼脂扩散试验示意图

（2）双向琼脂扩散试验　将抗原抗体分别加入琼脂板的不同小孔中，使两者同时在琼脂中扩散，当扩散至对应抗原抗体比例合适时，在抗原和抗体孔之间形成白色沉淀线。根据沉淀线的形状，可鉴定两种抗原是完全相同、部分相同或完全不同。主要用于抗原抗体的定性检测和两种抗原相关性分析。

（3）对流免疫电泳　是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向琼脂扩散技术高（图13－3）。

图13－3　对流免疫电泳示意图

2．免疫浊度法　是可溶性抗原、抗体在液相中特异性结合，形成肉眼看不见的小分子复合物，使反应液出现浊度，并能引起光散射。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物中抗原的含量。免疫浊度法又分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。该方法简便、敏感、快速，易于自动化，应用范围较为广泛。

（三）免疫标记技术

免疫标记技术（immunolabelling techniques）是利用荧光素、酶、放射性同位素、胶体金等标记物，标记抗体或抗原后进行的抗原抗体反应。其敏感性高、特异性强，能定性、定量，也能定位观察抗原、抗体及免疫复合物在组织细胞中的分布，是近年来发展较快、应用较广的一类免疫学检测技术。

1．免疫荧光技术（immunofluorescence technique）　是用荧光素作为标记物的免疫标记试验。该试验通过荧光显微镜，观察相对应的抗原和抗体结合成复合物所散发的荧光现象，常用于各类病原微生物标本的快速检查，以及组织切片中特异性抗原的检测，有直接法、间接法两种（图13－4）。直接法：用荧光素标记的已知抗体检测细胞涂片或组织切片中的相应抗原。间接法：用已知抗原特异性抗体（一抗）与标本中的抗原结合，洗涤后再用荧光素标记的抗Ig抗体（二抗）染色。

图13－4　免疫荧光技术

2．免疫酶技术（immunoenzymatic technique）　是用酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它将抗原抗体反应的高度特异性与酶催化底物的敏感性相结合，以酶作用于底物后是否显色及颜色的深浅来判定结果，可用肉眼或酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映待检样品中抗原或抗体的含量。常用的方法有酶联免疫吸附试验和免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）　简称酶标法，是目前广泛应用的一种微量、快速、特异的固相免疫酶技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（常用聚苯乙烯微量反应板）表面，再通过免疫酶的结合和底物显色过程进行检测。常用的方法（图13－5）有：双抗体夹心法（用于检查标本中的抗原）和间接法（用于检查血清中的特异抗体）。

图13－5　ELISA示意图

（2）免疫组化技术（immunohistochemistry technique）　是用标记的抗体与组织或细胞中的抗原反应，结合形态学检查，对抗原作定性、定量、定位检测的技术。

3．同位素标记技术　最常用的方法为放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA），是用放射性同位素作为标记物，标记抗原或抗体进行抗原抗体反应的免疫测定方法。同位素测定灵敏度很高，可自动化，常用于微量物质测定，但需特殊仪器设备并有一定放射性危害。

4．免疫胶体金技术　用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称为免疫胶体金技术。氯金酸（HAuCl₄）在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。而且胶体金的电子密度高、颗粒聚集后呈红色，制备简便，方法敏感、特异，因而广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域，除用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。