核磁共振法

1.概述

核磁共振法是研究立体化学的有效手段，是鉴定分子立体结构的强有力工具。随着不对称合成、手性药物的不断开发和研究，对对映体纯度及其构型的测定提出了更高的要求。在过去的几十年中，NMR这种快速、可靠、高灵敏度的分析手段在测定手性化合物的纯度和绝对构型方面，在手性识别机理、构象等方面的研究中得到了广泛的应用。

NMR在手性药物分析中的应用主要是对映体纯度分析、绝对构型确证和手性识别现象研究。在对映体纯度分析中，根据所用手性辅助试剂的不同，目前利用NMR技术对对映体进行纯度测定的方法主要有3种:

①手性衍生化试剂法(chiral derivatizing reagent，CDA):即采用手性试剂与被测样品直接反应生成稳定的非对映体衍生物，此法要求在制备过程中不发生外消旋化或动力学拆分作用，与CSR和CSA法不同，它们与底物形成严格的非对映体配合物，而且其非对映体不等价化学位移Δδ比CSA形成相关配合物的不等价化学位移Δδ大。

②手性位移试剂法(chiral shift reagent，CSR):将被测化合物至于手性位移试剂造成的手性环境中，待测物与这种手性环境间的非对映性相互作用在核磁共振谱图中表现出来。位移试剂一般由镧系金属离子(如铕Eu3+、镨Pr3+、镱Yb3+等)与作为配体的β－二酮反应形成六配位化合物，它的中心离子有空轨道，因此是一种Lewis酸，而有机化合物如胺、醛、醇、酮、羧酸等含有给电子基团，是Lewis碱，因此这些化合物可以与位移试剂形成弱的配合物。

③手性溶剂化试剂法(chiral solvating reagent，CSA):CSA与被测化合物以较弱的缔合作用力结合，迅速达到可逆平衡，通过氢键以及π－酸或π－碱的配合作用形成各自的非对映体的缔合物，表现出化学位移不等价。这种不等价来自两个方面:所生成的两种非对映体的固有的不等性和各自非对映体缔合物的结合程度不同。

其中CDA法是间接法，需通过衍生化反应，CSR和CSA法是直接法，即给对映体提供一个外部的手性环境。

2.应用实例

实例:以(R)－(－)－α－甲氧基苯乙酸(MPA)为手性转移试剂的1 H NMR法分析测定莫达非尼原料药和制剂中的R/S对映体

发作性睡病是以白天睡眠过多为症状的中枢神经系统疾病，传统方法是以中枢神经系统激动剂如安非他命等治疗，但效果不佳。近年来，莫达非尼(其结构如图9－14所示)以其能够明显提高患者清醒度以及具有治疗发作性睡眠病、呼吸不全综合征方面的潜力而受到广泛关注。莫达非尼的化学结构中有一个不对称的硫氧功能基而具有手性，临床上一般用其消旋体给药。但据报道，S－(+)－莫达非尼的消除速率是R－(－)－莫达非尼的3倍，所以对于两种对映体的分离分析对于临床安全给药具有重要意义。

(1)实验方法

本实验采用手性转移试剂(CSR)的1 H NMR法，分析测定莫达非尼(MDL)原料药对映体，考察了三种不同的CSR对于对映体分离分析的影响，包括(R)－(－)－α－甲氧基苯乙酸(MPA)、(S)－(－)－1，1’－(2－萘酚)(S－BINOL)和(R)－(+)－α－甲氧基－α－三氟醚苯乙酸(MTPA)，还考察了CSR本身的性质以及底物与CSR的比例(MDL:CSR)对对映体分离分析的影响。最后，将所建立的方法用于MDL制剂的对映体纯度的分析中，并考察了线性、回收率、检测限和定量限。

图9－14　莫达非尼对映体及其与R－MPA氢键结合示意图

(a)R－MDL与R－MPA;(b)S－MDL与R－MPA

(2)结果与讨论

溶剂的选择由于MDL在CDCl3和DMSO－D6中易溶，而在D2O中部分溶解，所以考察了不同比例的CDCl3和DMSO－D6对MDL中两个质子的分离的影响。如图9－15所示，当溶剂全部为CDCl3时，连在氮原子上的两个质子的分离效果最好，且不受其他峰的干扰，所以选择CDCl3为实验溶剂。

CSR的种类、浓度、与底物比值对对映体分离分析的影响如图9－16所示，对于MPA和MTPA，随着CSR浓度的增高，诱导化学位移值(ΔΔδ)明显增大，且对于MPA随着MDL:CSR数值的减小，分离度增大;而对于S－BINOL，ΔΔδ变化不明显，且峰不能良好分离。这主要是由于CSRs与MDL之间形成氢键的能力以及形成复合物的稳定性不同，MTPA、MPA以及BINOL的pKa值分别为～2.5，～3.8和8.2，而MDL中的硫原子呈亲核性、碱性，因此MTPA和MPA与MDL之间因形成酸碱相互作用而相互结合，BINOL则不能。综上，选择MPA为最佳CSR。此外，实验还考察了不同的MDL CSR数值对对映体分离的影响，考虑峰展宽程度，最终选择MDL MPA比例为1 3。

图9－15　不同比例的CDCl3和DM SO－D6对MDL中两个氢质子分离的影响

图9－16　不同浓度MPA、MTPA和BINOL对MDL中质子ΔΔδ的影响(a);MDL CSR数值不同对1 H NMR信号峰分离度的影响(b)

(3)方法学考察

如图9－17所示，该方法在0.5～5.0 mg范围内线性关系良好，检测限为0.02 mg·mL－1，定量限为0.06 mg·mL－1。无论是原料药还是制剂，两种对映体过量(ee%)的回收率RSD值均在0.5%以下，符合相关要求。表明方法灵敏度高、专属性强，可以用于MDL对映体的纯度分析。

图9－17　方法的线性(a)、定量限和检测限(b)考察