免疫荧光组织(细胞)染色方法主要分为直接法、间接法和补体法,可用于冷冻组织切片、细胞涂片、印片或培养细胞爬片,也可用于石蜡组织切片。不同染色方法的差别取决于荧光素标记的成分及荧光免疫复合物的形成过程,但组织(细胞)标本处理方法的要求基本相同。冷冻切片、细胞涂片、印片或培养细胞爬片用冷丙酮(4℃)固定10min,PBS (p H7.2~7.6)充分洗涤;石蜡组织切片常规脱蜡,按要求修复或不修复抗原,PBS (p H7.2~7.6)洗涤(操作步骤同本章第三节)。
(一)直接法
该方法简便、特异性强,但敏感性较差,应用范围较窄。
1.基本原理 用荧光素标记的抗体或抗原直接作用于载片上的组织、细胞,检测对应抗原或抗体的存在状况。
2.操作程序
(1)组织(细胞)标本处理。
(2)滴加适当稀释的荧光抗体(或荧光抗原),置于湿盒,37℃温育30~60min或4℃过夜。
(3)PBS洗3次,每次3min。
(4)蒸馏水洗1min。
(5)用50%缓冲甘油封固,荧光显微镜观察。
(二)间接法
该方法敏感性好,适用范围广。
1.基本原理
(1)检测未知抗原:用已知抗体(一抗)与切片上待测未知抗原结合,再用荧光标记抗体(二抗)与一抗结合,形成待测抗原-一抗-荧光标记二抗复合物。
(2)检测未知抗体:用已知抗原与切片待测未知抗体结合,再用荧光标记抗体(抗已知抗原)与抗原结合,形成待测抗体-已知抗原-荧光标记抗体复合物。
2.操作程序
(1)组织(细胞)标本处理。
(2)滴加适当稀释已知抗体(一抗)或已知抗原,标本置于湿盒,37℃温育30~60min或4℃过夜。
(3)PBS洗3次,每次3min。
(4)滴加适当稀释荧光标记抗体(二抗或抗已知抗原抗体),标本置于湿盒,37℃温育30~60min,应注意避光。
(5)PBS洗3次,每次3min。
(6)蒸馏水洗1min。
(7)用50%缓冲甘油封固,荧光显微镜观察。
(三)补体法
可用于补体结合反应的抗原抗体系统检测,该方法不仅敏感,且不受抗体种属特异性限制,一种抗补体荧光抗体可以与不同种属来源的第一抗体结合,即可用于检测多种目标抗原。
1.组织免疫复合物直接检测 一些自身免疫性疾病患者的病变部位常有抗原抗体补体复合物沉积,用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片,与复合物结合形成抗原抗体补体复合物-抗补体荧光抗体复合物,荧光显微镜下的阳性荧光部位就是免疫复合物上补体的存在部位。此法常用于肾穿刺组织活检病理诊断。操作程序如下。
(1)组织(细胞)标本处理。
(2)滴加稀释好的抗补体荧光抗体,标本置于湿盒,37℃温育30~60min或4℃过夜。
(3)PBS洗3次,每次3min。
(4)蒸馏水洗1min。
(5)用50%缓冲甘油封固,荧光显微镜观察。
2.组织抗原间接检测 将新鲜补体与第一抗体混合同时加到切片上,当第一抗体与相应抗原结合,补体也会与相应抗原抗体复合物结合形成抗原-抗体-补体复合物,再用抗补体荧光抗体与该复合物的补体反应,形成抗原-抗体-补体-荧光抗体复合物。操作程序如下:
(1)组织(细胞)标本处理。
(2)滴加适当稀释第一抗体与补体等量混合液,标本置于湿盒,37℃温育30~60min或4℃过夜。
(3)PBS洗3次,每次3min。
(4)滴加适当稀释抗补体荧光抗体,标本置于湿盒,37℃温育30~60min。
(5)PBS洗3次,每次3min。
(6)蒸馏水洗1min
(7)用50%缓冲甘油封固,荧光显微镜观察。
(四)补充说明
1.甘油缓冲液配制 甘油(分析纯)20ml,加0.5mol/L p H为9.5的碳酸盐缓冲液20ml,充分混合,气泡消失后即可使用。
2.碳酸盐缓冲液(0.5mol/L、p H9.0~9.5)配制 Na HCO3 3.7g,Na2 CO3 0.6g加蒸馏水至100ml。
3.荧光抗体保存和使用 若近期使用,在0~4℃保存,否则应在-20℃保存,以防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度1∶(500~1000)的硫柳汞或叠氮钠。新购抗体先分装成若干份,-20℃冷冻或低温冰箱保存,使用前拿出一支稀释,现配现用,以避免反复冻融影响抗体效价。使用过程中抗体应避光。
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