便隐血检测

当胃肠道少量出血时，粪便外观不显血色，这类出血称为隐血。镜检不能证实，而必须用化学方法加以检测，称为隐血试验（occult blood test，OBT）。正常人粪便隐血试验为阴性。阳性常见于消化性溃疡的活动期、胃癌、钩虫病以及消化道炎症、出血性疾病等。消化性溃疡隐血试验呈间断阳性，消化道癌症呈持续性阳性，故本试验对消化道出血的诊断及消化道肿瘤的普查、初筛和监测均有重要意义。

1864年Vandeen发明了Guaiac方法来检查便隐血，1901年Boas开始用这种方法来诊断胃肠道出血，传统的隐血试验是利用血液中红细胞的血红蛋白的亚铁血红素具有类过氧化物酶作用，能分解H2O2为水和活性氧而设计的简易化学试验。这类方法虽然成本低廉、简单易行，但特异性差、灵敏度较低，易受食物及服用药物成分的影响。为解决传统隐血试验特异性差的问题，人们探索了一些新的隐血试验方法，如同位素铬（51　Cr）法等同位素法和各种免疫学方法。尽管同位素方法的灵敏度和特异性无可非议，甚至还可以对出血点进行准确的定位，但临床很难接受将一种应用放射性同位素、操作复杂、需要特殊仪器的方法普遍用来进行一个没有特异性指标的检验。近年来某些实验室还采用卟啉荧光法检测血红蛋白定量试验，除可测未降解的血红蛋白外，还可测血红素衍化物卟啉，从而克服了化学法和免疫法受血红蛋白降解影响的缺点，但对上、下消化道出血同样敏感，而外源性血红素、卟啉类物质具有干扰性，且方法较复杂，故不易推广使用。

免疫学方法以其特异性和灵敏度而广受临床检验的欢迎。基于免疫反应的隐血试验方法是当前发展最快也最有临床实用价值的隐血试验方法。应用免疫学方法的隐血试验具有很好的灵敏度，一般血红蛋白为0．2mg／L或0．03mg／g的粪便就可得到阳性结果，且有很高的特异性，各种动物血红蛋白在500mg／L、辣根过氧化物酶在2000mg／L时不会出现干扰，因而不需控制饮食。

根据文献报道，有三类抗体可用于粪便的隐血试验：一种为抗人血红蛋白抗体，一种抗人红细胞基质抗体，另一种为抗血液中其他成分如抗α1-AT、Tf、Hb-Hp等。采用抗α1-AT、Tf、Hb-Hp等抗体的隐血试验对所有消化道出血均呈阳性反应；而抗人血红蛋白法和抗人红细胞基质法隐血试验主要检测下消化道出血，有40%～50%的上消化道出血不能检出，原因是：①血红蛋白或红细胞经过消化酶降解后消化殆尽已不具有原来免疫原性；②过量大出血而致反应体系中抗原过剩出现前带现象；③病人血红蛋白的抗原与单克隆抗体不配。因此，抗人血红蛋白法或抗人红细胞基质的隐血试验目前被认为是对大肠癌普查最适用的试验。为了使免疫学方法在检测粪便隐血时尽可能简便，以适应大规模大肠癌普查的需要和临床快速报告的要求，有的公司已经推出单克隆抗体一步法试验，如美国万华普曼生物工程有限公司。他们所采用的粪便隐血免疫一步法是一种快速简便，无臭无味的三明治夹心免疫检验法。具有特异性强、高灵敏度（0．03mgHb／g粪便）、检验快速（1～5min）、便操作简单（一步检验）、试剂易保存（室温）和结果简单易读的优点，在诊断和治疗引起肠胃道出血的疾病有重要意义。特别是消化道癌肿患者87%便隐血为阳性。但是，据Herzog和Cameron等研究，正常人24h胃肠道生理性失血量为0．6ml，由于免疫学方法的高度敏感性，在某些正常人，特别是服用刺激肠道药物后或处于应激反应状态时也可能造成假阳性。

（一）免疫法

【检测原理】　目前国内外多数实验室便隐血的免疫学法检测使用胶体金技术与单克隆技术结合的试验方法。其原理是：胶体金是由氯化金和枸橼酸合成的胶体物质，具有胶体化学性质，颗粒均匀呈现在液体状态中。胶体金性质稳定，又能呈现紫红颜色。而单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强的特性，二者结合，可以形成一种稳定性较强的产品。免疫胶体金法采用单克隆和多克隆抗体，特异性地与粪便样品中的人血红蛋白结合，不受饮食限制，能准确检测无症状、少量、持续、肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血或铁剂等药物的干扰。可作为定性和半定量诊断。其操作简便，结果判断准确、迅速。

在免疫法的基础上，试剂生产商又根据不同的需求，生产出了免疫一步法、免疫化学双联检测法等多个品种的检测条和检测板以及便隐血自动分析仪。

【适应证】　适用于消化道出血性疾病，特别是消化道肿瘤的早期发现和诊断。

1．检测板法

【标本采集】

（1）用采便棒在粪便标本的6个不同部位取粪便，以全部覆盖采便棒远端螺旋状沟槽为宜。

（2）将采便棒放回采便器内，将盖拧紧，充分混匀，制成待测标本。

【操作方法】

（1）取出检测板，平放在桌面上，将采便器顶端盖拧下，将3～5滴粪便混悬液滴入检测板的圆孔中。

（2）1～3min后观察结果，最长不超过5min。

【结果判读】

（1）在检测区和对照区各出现一条红线，为阳性结果。

（2）如果仅在对照区出现一条红线，在检测区不出红线，为阴性结果。

（3）如果在对照区不出红线，则属于无效结果，请重新检测。

【参考范围】　定性结果一般为阴性。

2．检测条法

【标本采集】

（1）在样品杯中滴加0．5ml蒸馏水。

（2）用采便棒在粪便标本的6个不同部位取便，以全部覆盖采便棒远端螺旋状沟槽为宜。

（3）将采便棒放到样品杯中，充分搅拌混匀，制成待测标本。

【操作方法】

（1）除去外包装，取出试纸条。

（2）将试纸检测端放入待测标本中，液面不得超过MAX线，1min后取出，5min内判读结果。

【结果判读】　同检测板法。

【方法学优点】

（1）特异性强：仅特异性地针对人血红蛋白，其他动物肉类、含有过氧化物酶的新鲜蔬菜、铁剂、维生素C等对此试验无干扰作用。

（2）灵敏度高：胶体金法检测血红蛋白的范围是0．2～2　000 μg／ml。

（3）准确性好：单克隆抗体法准确率达到99．9%。

（4）检测时间短，1min内可显示，5min做出诊断。

（5）携带、使用方便。

【参考范围】　定性结果一般为阴性。

【局限性】　单一的免疫法试验主要检测下消化道出血，有一部分上消化道出血不能被检出。主要原因有以下几种。

（1）血红蛋白或红细胞经过消化酶的作用，或降解变性，或消化殆尽，已不具有原来的免疫原性。当血液在胃中停留超过4h、在肠道中超过8h后，免疫胶体金检测法可出现假阴性。

（2）过量的大出血导致反应体系中抗原过剩，而出现前带现象。

（3）患者血红蛋白的抗原与单克隆抗体不匹配。因此有时外观为柏油样便，而免疫法检查却呈现阴性或弱阳性。

（4）触珠蛋白（HP）是一种具有结合血红蛋白能力的α2-唾液糖蛋白，在粪便中的稳定性比血红蛋白高4倍，有文献表明，当有过量HP时，血红蛋白单克隆抗体法检测结果会出现假阴性，煮沸样本1min后，可以消除干扰。

（5）虽然一般动物性食品不会对检测造成影响，但仍应在检测前控制食用动物性血红蛋白类食品，因为较大量的动物性血红蛋白容易导致假阳性。

（6）对柏油样便等特殊样便必须进行大比例的稀释。

（7）使用免疫胶体金检测法时，pH不宜很高，离子强度也不宜很高。这是因为胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。离子强度很高也会引起蛋白质聚集。两种情况都会破坏胶体金的稳定性，从而导致结果无效。

【注意事项】

（1）由于免疫法对于变性的血红蛋白几乎不发生反应，因此粪便标本在留取后应尽快送检，以免造成假阴性结果。

（2）正常人便隐血检测结果阳性，可能是由于某些药物（如阿司匹林等）刺激胃肠道造成的隐性出血。

（3）在粪便形成的过程中，少量的消化道出血不一定与之混合均匀，而且消化道出血具有间断性，所以需要连查3次，以获得准确结果，只要有一次结果为阳性，就可认为有隐性出血存在。

（4）如果处于月经期或有尿血、口鼻腔出血等可引起试验的假阳性。

（5）便隐血胶体金法检测试纸只是一种定性的筛查大便隐血的方法，并不能确定标本中的血量。

（6）对于可疑的结果应做进一步检查，并再进行连续检测。

（二）双联法

【检测原理】　是将免疫胶体金检测方法和化学检测方法结合的一种隐血检测方法。免疫胶体金法采用单克隆和多克隆抗体，特异性地针对粪便样品中的人血红蛋白，可以检出最低量为0．2μg／ml的血红蛋白，不受饮食的限制，能准确检测无症状、少量、持续、肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血或铁剂等药物的干扰。化学法是利用血红蛋白的过氧化物酶活性进行检测。虽然化学法的灵敏度偏低，交叉反应比较严重，但当粪便中血红蛋白含量越高时，其结果显示越快速、越清楚。两种方法可以做有效的补充和对照。

【标本采集】　同免疫法。

【操作方法】

1．检测板法

（1）取出检测板，平放在桌面上，将采便器顶端盖拧下，将3～ 5滴粪便混悬液滴入检测板的圆孔中。

（2）1～3min后观察结果，最长不超过5min。判读完免疫法结果后，将化学法检测液滴加到检测板的圆孔内，1min内判读化学法的结果。

（3）根据免疫胶体金法和化学法的结果判断便隐血双联法试纸的最终结果。

2．检测条法

（1）除去外包装，取出试纸条。

（2）将试纸检测端放入待测标本中，液面不得超过MAX线，1min后取出，5min内判读结果。判读完免疫法结果后，将化学法检测液滴加到已被样本溶液浸湿的化学检测试纸片上，1min内判读化学法的结果。

（3）根据免疫胶体金法和化学法的结果判断便隐血双联法试纸的最终结果。

【结果判读】

1．化学法结果判读方法

（1）在滴加化学法检测液后1min内纸片从浅黄色变成蓝色，为阳性结果。

（2）如果不变色则为阴性结果。

（3）如果化学检测试纸片呈现花色，则属于无效结果，请重新检测。

2．双联法试纸最终结果的判断方法

（1）免疫胶体金法和化学法均显示阳性结果时，结果为阳性。

（2）免疫胶体金法呈现阳性结果，但化学法呈现阴性结果时，判定为样本中血红蛋白含量较低，结果为阳性。

（3）免疫胶体金法呈现阴性结果，但化学法呈现阳性结果时，有两种情况：①样本中含有动物血或有过氧化物酶活性的蔬菜汁造成化学法出现假阳性；②样本中含有极大量的血红蛋白，免疫胶体金法会出现阴性。此时可对样本进行高倍稀释检测，如稀释后免疫胶体金法检测结果仍呈现阴性，则属于情况①，最终结果判为阴性；如稀释后免疫胶体金法检测结果呈阳性，则属于情况②，最终结果判为阳性。

（4）免疫胶体金法和化学法均显示阴性结果时，结果为阴性。

（5）当免疫胶体金法试纸出现无效结果时或化学法检测纸片出现花色时，判定整体结果为无效，需要重新进行检测。

【参考范围】　定性结果一般为阴性。

【方法学优点】

1．双联法兼有免疫胶体金法和化学法的优点，在同一份标本检测中同这两种方法进行检测，可以有效地进行互补和对照。

2．操作简单、快捷。

3．结果易于判读。

【注意事项】

1．虽然化学法对于变性的血红蛋白也发生反应，但由于免疫法对于变性的血红蛋白几乎不发生反应，因此粪便标本在留取后应尽快送检，以免产生错误判定结果。

2．由于H2O2在常温中易于分解，所以过氧化氢溶液应在4～8℃的环境中密封避光保存，且放置时间不宜过久，以免造成假阴性。

3．像其他检测方法一样，便隐血双联法检测试纸不能对胃肠道出血性病变做结论性的诊断，只能作为筛查或辅助诊断。对于阳性结果，应结合临床做进一步的检查。

（三）便隐血自动分析仪

【检测原理】　多克隆抗体技术，免疫比浊法，一点速率法。

【标本采集】

1．拧开采便器的瓶盖，将采便棒拔出。

2．用采便棒在粪便标本的表面反复刮擦（以全部覆盖采便棒远端螺旋状沟槽为宜）。

3．将采便棒放回采便器内，将盖拧紧，充分混匀，制成待测标本。

【操作方法】

1．将比色杯放在样本架上，然后放在仪器指定的位置。

2．将装有待测标本的采便器进行编号，按要求放在样本架上，然后再放到仪器指定的位置。

3．按下仪器的“开始”按钮，仪器自动检测比色杯和样本。

4．大约7min后，仪器自动打印出所检测标本的相关检测数据及检测结果。

【参考范围】　定性结果一般为阴性。

【方法学优点】

1．仪器体积小巧，占用面积小。

2．操作简单，测试快捷。每小时可测试80个样本，第1个结果仅需7min。

3．运用数值检测方法，可检测粪便中血红蛋白的含量。

4．可自动定标。自动绘制定标曲线，并可修正定标曲线。

5．重复性好。进样针可自动清洗，减少交叉污染。

【临床意义】

1．消化道肿瘤：在胃癌、结肠癌、直肠癌等疾病时，隐血阳性率可达95%以上，可呈持续阳性。因此在中老年患者中使用此检测进行不定期监测，可以早期发现消化道肿瘤。

2．消化道疾病：消化道溃疡、肠结核、溃疡性结肠炎、结肠息肉等隐血可呈阳性。在消化道溃疡时，阳性率为40%～70%，并可呈间断性。

3．服用阿司匹林、糖皮质激素等药物可隐血阳性。

4．钩虫、血吸虫等寄生虫感染时可隐血阳性。