肺炎支原体抗原

支原体（mycoplasma）是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但缺细胞壁的原核微生物，能在无生命的人工培养基上生长的病原微生物中的最小者，直径0．2～0．3μm，能通过滤菌器，是介于细菌和病毒之间的一种“胸膜肺炎样微生物”（pleuropneumonia-like organism，PPLO），1967年正式命名为支原体。对人致病的支原体主要有肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，Mp）、人型支原体（mycoplasma hominis，Mh）、生殖道支原体（mycoplasma genitalium，Mg）、解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，Uu）。

Mp无细胞壁，不能维持固定的形态而呈球状、杆状、丝状等多种多形态，只有三层结构的细胞膜，细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。革兰染色阴性，一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体黏附于呼吸道黏膜上皮细胞表面，与致病性有关。凡能作用于胆固醇的物质（如两性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。肺炎支原体对热抵抗力差，通常55℃经15min可灭活，37℃时只存活几小时，苯酚、来苏儿易将其杀死。能耐冰冻。

随着致病原的变迁，肺炎支原体感染在婴幼儿呼吸道感染中已占到30%左右，成为婴幼儿致病的重要病原。肺炎支原体是引起非典型性肺炎的常见病原体。可引起小儿上呼吸道感染、咽炎、气管炎、支气管炎、肺炎。肺炎支原体肺炎一年四季均可发生，秋冬季是肺炎支原体疾病的发病高峰。肺炎支原体在非流行期间约占小儿肺炎病原的10%～20%，流行年份则高达30%。肺炎支原体潜伏期2～3周。患儿主要表现为发热，特征是高热、咳嗽重，常呈阵发性痉咳，体温大多在39℃左右。婴幼儿表现出喘憋和呼吸困难。其中3%～10%可以发展成支原体肺炎。人类对Mp无先天免疫，感染后也不能产生完全的保护性免疫。

正确选择抗生素是治疗支原体肺炎成败的关键。由于支原体躲在细胞内，而青霉素类及头孢菌素类药物在细胞内浓度很低，加之这两种抗生素是通过破坏细菌的细胞壁杀灭细菌的，而肺炎支原体没有细胞壁，使得以上两种抗生素“无能为力”。临床应用证实红霉素在细胞内浓度很高，可以杀灭支原体，但是红霉素不良反应较大，近年已用阿奇霉素代替，后者作用时间长，每天只需服用1次，不良反应相对较少。一般需服用2～3周药物，否则容易复发。

Mp的实验室检测包括①Mp快速培养：取咽拭子接种于肺炎支原体快速鉴定培养基中24h可以出结果。②冷凝集试验：滴度＞128有诊断价值，但阳性率仅50%左右。③抗原检测：使用抗原捕获酶免疫测定，敏感性较高。④补体结合试验（CFT）：所用抗原为Mp的氯仿-甲醇糖脂抽提物，与人类、细菌及植物的某些抗原表位发生交叉反应，因此敏感性和特异性不高。⑤间接血凝试验（PHA）：不能区分抗体的类型，单份血清不能确定是既往感染还是现症感染。⑥明胶颗粒凝集试验（PA）：同PHA。⑦酶联免疫吸附试验（ELISA）：可分别检测IgM、IgG、IgA，可确定是既往感染还是现症感染。⑧金标快速检测：只能进行定性检测，无法观察血清转化情况。其中抗原捕获酶免疫测定、酶联免疫吸附试验（ELISA）和金标快速检测是常规实验室最理想的快速检测肺炎支原体的方法。

（一）肺炎支原体抗原检测

【检测原理】　从标本中提取肺炎支原体抗原，并将其固定在检测小杯的表面，然后加入鼠单克隆抗体（一抗），与肺炎支原体抗原结合，随后加入标记有过氧化物酶的羊抗鼠抗抗体（酶标二抗），最后，通过与产色底物作用，得出有色反应结果。

【适应证】　呼吸道感染，尤其是肺炎的诊断与鉴别诊断。

【标本采集】　各种体液标本、拭子标本、液体培养基标本均适用。标本的采集无需使用运输培养基，因活的、死的肺炎支原体均可被检测。采集并密封好的标本可在2～8℃保存48h；或-20℃保存2周。若有必要，标本可用黏液溶解剂进行黏液的液化。

【参考范围】　阴性。

【操作方法】

1．放置漏斗　在每只小杯上放置一漏斗，直到判断试验结果时方可移去。

2．抗原固定　向阴性质控和待测小杯中各滴加4滴提取液，向阳性质控小杯中滴加质控品4滴，待渗干。

3．洗涤　每杯各加入5滴洗涤液并待其渗干，重复洗涤一次。

4．抗体结合　向阴性质控小杯中滴加1滴阴性质控品，待测小杯和阳性质控小杯中各滴加1滴鼠抗肺炎支原体抗体，等待2min。

5．洗涤　每杯各加入5滴洗涤液并待其渗干，重复洗涤一次。

6．抗抗体结合　每个小杯各加1滴抗抗体，等待2min。

7．洗涤　每杯各加入5滴洗涤液并待其渗干，重复洗涤一次。

8．显色　每个小杯各加入1滴显色液，等待5min，移去漏斗，在5min内观察颜色反应。

【结果判读】

1．阴性质控：白色或淡绿色。

2．阳性质控：蓝色或蓝绿色。

3．检测结果若显色较阴性质控强，则可判断为阳性。若显色较阴性质控相同或更弱，则可判断为阴性。

【临床意义】　直接检测标本中肺炎支原体抗原，可用于临床早期快速诊断。

【局限性】　由于活的和已死的肺炎支原体均可被检测，无法确定是否现行感染。

（二）肺炎支原体（IgM、IgG）抗体

【检测原理】　采用提纯的肺炎支原体膜蛋白抗原预包被板ELISA原理，检测人血清（血浆）中存在的肺炎支原体的IgM、IgG抗体，并配以酶标记抗人IgM、IgG单克隆抗体作为标记物。加入底物TMB显色后终止反应，在450nm波长测各孔OD值，OD值的大小与待检抗体含量成正比。

【标本采集】　血清、血浆。

【适应证】　对新生儿、婴幼儿及儿童和成人呼吸道近期感染的诊断与鉴别诊断具有重要的价值。

【操作方法】

1．试验前试剂盒自冰箱中取出后应置室温（18～25℃）平衡30min以上。

2．打开试剂盒，用蒸馏水将20X浓缩洗液做1∶20稀释配成洗涤工作液，然后充分混匀备用。

3．标本处理。准确吸取待检血清5μl加入到500μl的样品稀释液中，充分混匀，室温（18～25℃）作用至少10min。

4．分别取100μl已稀释的样本加入到板孔内，同时设强阳性和弱阳性对照各一孔，阴性对照两孔，取阴阳对照血清100μl直接加入。37℃孵育30min。

5．孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）。重复洗涤过程4次，将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体。

6．加入100μl酶结合物于相应孔内，37℃孵育30min。

7．孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）。

8．按顺序分别加入底物A和B各50μl，37℃孵育（10±1）min。

9．终止反应：每孔内加入50μl终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。

10．以空白孔调零，用酶标仪测定各孔的OD450，如双波长建议参考波长范围为620～690nm（例如620nm）。

【结果判读】

1．结果有效性　阳性对照孔OD值／阴性对照孔OD值，即P／N≥2．1，对照成立，否则应重新实验。

2．cut off值计算　cut off值＝阴性对照孔平均值×2．1。

3．结果判定　待测样品的OD450值≥cut off值者，判为阳性，否则阴性。阴性对照孔OD小于0．05时按0．05计算。

【临床意义】　Mp的IgM类抗体出现早，一般在感染后1周出现，3～4周达高峰，以后逐渐降低。由于肺炎支原体感染的潜伏期为2～3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，则不能否定肺炎支原体感染，需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，5周左右达峰值，在体内持续时间长（4年左右），需动态观察，如显著升高提示近期感染，显著降低说明处于感染后期。由此提示IgG与IgM同时测定，可提高诊断率，达到指导用药、提高疗效的目的。

【方法学优点】　血清、血浆经预吸收后非特异性因素（如RF因子和变性或聚合的人IgG）的影响被彻底消除，特异性高。