免疫分子的检测

一、免疫球蛋白的测定

Ig广泛存在于血液、组织液及外分泌液中，以血清中含量最高，但其正常值范围较大，并随年龄、性别及人种等而变动。Ig的病理性改变表现为含量或组分异常，通过血清蛋白电泳图谱分析，有助于骨髓瘤、无丙种球蛋白血症及轻链病等的鉴别诊断。检测IgG、IgA、IgM含量常用单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法及免疫比浊法。目前，使用免疫化学自动分析仪，可同时测定血清中多种Ig、补体成分及其他血浆蛋白的含量。血清中IgE和IgD含量很低，需用RIA、ELISA、电化学发光等灵敏度较高的方法测定。过敏性疾病患者血清中特异性IgE可采用放射变应原吸附试验（radioallergo－sorbyent test，RAST）、ELISA等方法测定。

免疫球蛋白E（IgE）在变态反应（Ⅰ型变态反应）和抗寄生虫感染中起重要作用。正常情况下血清IgE的含量很低（低于血清免疫球蛋白总量的0．001%）。IgE浓度与年龄有关，新生儿含量最低，以后逐渐增高，5～7岁达到稳定水平。但特定年龄段的人群，IgE含量变化还是较大。IgE含量正常不能排除过敏性疾病。IgE在变态反应中有重要意义，但其含量升高还可见于枯草热、过敏性支气管炎和皮炎。因此，在临床鉴别诊断过敏性和非过敏性疾病时，定量测定人血清或血浆中IgE的含量只有与其他临床检查联合应用才有实际意义。非变态反应性疾病血清IgE含量也可升高，见于支气管肺曲霉病、威－奥综合征、高IgE综合征、IgE骨髓瘤和寄生虫感染。血清IgE的正常参考值：男性：31～5 500 μg／L或（631±128）U／ml，女性：31～2 000μg／L或（337±60）U／ml，（1U＝2．4ng）。

免疫球蛋白A主要由黏膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由胃肠淋巴样组织合成，少部分由呼吸道、唾液腺和生殖道黏膜组织合成。血清型IgA占血清总Ig的10%左右。慢性支气管炎发作与分泌型IgA的减少也有一定的关系。分泌型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA可结合饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。血清IgA正常参考值：0．5～4．0g／L。

免疫球蛋白G主要由脾、淋巴结中的浆细胞合成和分泌，以单体形式存在。IgG在机体免疫防护中起着主要作用，大多数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于IgG类抗体。不少自身抗体如抗甲状腺球蛋白抗体、系统性红斑狼疮的LE因子（抗核抗体）以及引起三型变态反应免疫复合物中的抗体大都也属于IgG。血清IgG正常参考值：6．0～16．0g／L。

血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量最大，为970kD，沉降系数为19S，又称为巨球蛋白。IgM占血清总Ig的5%～10%。

二、补体C2、C3、C4等成分测定

血清补体活性与含量测定有助于了解机体补体系统的激活状况、合成功能及代谢平衡等，对有关疾病的鉴别诊断和发病机制的研究具有重要意义。

1．血清总补体活性测定　应用家兔抗SRBC（sensitization red blood cell）抗体致敏的SRBC作为抗原－抗体复合物，激活待测血清中补体经典途径，导致SRBC溶解，若待测血清样品中补体含量减少或某种补体成分缺失，可影响此种溶血反应。通常以50%溶血作为判定反应结果的终点，故称为50%溶血试验，即CH50（50%complement hemolysis）。根据引起50%溶血所需的最小补体量，计算血清的总补体活性。

2．血清补体旁路途径活性测定　正常家兔红细胞（rabbit red blood cell，RRBC）可直接激活B因子，引起补体旁路途径活化，导致RRBC溶解。此法可用于人和其他动物血清补体旁路途径活性的测定。此外，也可用包被眼镜蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）的鞣酸化红细胞来测定补体旁路途径的溶血活性。

3．补体各种成分的测定　补体系统由30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成。临床应用较多的指标为C1q、C3、C4、B因子和C1INH（C1esterase inhibitor）。其测定方法主要有免疫溶血法和免疫化学法。补体测定的临床意义。补体C3增高：急性心肌梗死、皮肌炎、结节性动脉周围炎、急性风湿病、溃疡性结肠炎、组织损伤期及糖尿病等；减低：急性和某些慢性肾小球肾炎，各种活动性自身免疫病如慢性肝病、SLE、自身免疫性溶血性贫血及链球菌感染后肾病等。正常参考值：79～152mg／dL。补体C4增高：风湿热急性期、急性心肌梗死、皮肌炎、结节性动脉周围炎、Reiter综合征和各种类型的多关节炎；减低：自身免疫性慢性活动性肝炎、SLE活动期、多发性硬化症、类风湿性关节炎、IgA肾病、链球菌感染等。正常参考值：16～38mg／dL。

4．补体裂解产物的测定　对补体裂解产物的检测，不仅能反映补体系统活化程度，亦有助于某些疾病的诊断和病情监测。常用的检测方法主要有免疫电泳、交叉免疫电泳、ELISA及RIA等，通常测定血浆中C3a、C3d、C5a和补体终末复合物SC5b～9水平。

5．补体受体的测定　补体受体缺陷可导致某些疾病的发生，如红细胞表面CRI表达减少，可引起循环免疫复合物（circulating immune complex，CIC）清除障碍，导致某些自身免疫病的发生；白细胞黏附缺陷（leukocyte adhesion deficiency，LAD）患者的CR3和CR4β链（CDl8）基因突变，导致CR3与CR4缺失，患者易反复发生化脓性感染。

常用的检测方法为EAC（erythrocyte antibody complement）花环试验、荧光素标记细菌－补体（fluorescein labeled bacteria complement，FBC）花环试验、酵母多糖－补体花环试验等。

三、细胞因子及其受体的检测

1．生物学检测法　根据细胞因子特定的生物学活性，采用相应的指示系统（如各种依赖性细胞株或靶细胞），通过与标准品对比，判断样品中细胞因子活性水平，一般以活性单位（U／ml）表示。细胞因子生物学活性测定方法可分为促进细胞增生或增生抑制法、集落形成法、细胞毒活性测定法、细胞病变抑制法、趋化作用测定及细胞因子诱导产物分析法等。细胞因子生物学检测法的优点是：方法灵敏，可测出pg水平，并能直接显示细胞因子的生物活性。缺点：多种细胞因子具有相同功能，故干扰因素较多。

2．免疫学检测法　细胞因子都可借助免疫学方法进行检测。常用的方法包括ELISA（双抗体夹心法或竞争法）、RIA、免疫印迹法及免疫聚合酶链反应（immuno－PCR）等。

免疫学检测方法的优点：①特异性强，可测出单一细胞因子的含量，并能鉴别细胞因子的亚型。如TNF－α和TNF－β（淋巴毒素）的生物学活性相同，只有用免疫学方法才能鉴别之；②方法简便，不需进行细胞培养，便于大量样品检测；③实验流程短，方法易标准化，重复性好。缺点：①免疫学方法所检出的细胞因子含量，与该因子生物活性并非必然平行；②不同单克隆抗体所识别的细胞因子表位和亲和力不同，所测结果可出现差异。

3．分子生物学方法　应用细胞因子cDNA探针或根据已知核苷酸序列人工合成的寡核苷酸探针，经放射性核素（32P或35S）、生物素或地高辛标记，与提取的细胞因子mRNA（messenger ribonucleic acid）或DNA分别进行DNA－RNA杂交（Northern blot）或DNA－DNA杂交（Southern blot）；亦可在细胞或组织切片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化技术，还可鉴定表达细胞因子基因的细胞类型。

分子生物学方法的优点是：特异性高，可避免生物活性检测中可能存在的其他细胞因子的影响。但此法只能检测细胞因子基因表达的情况，不能直接提供有关因子的含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究细胞因子基因的表达与调控。

4．细胞因子受体的检测

（1）活细胞吸收试验：将过量的待测细胞与限量细胞因子（配体）反应，若胞膜表面存在相应受体，即可与配体（细胞因子）结合，检测回收的配体生物活性的丧失情况，可确定受体是否存在。此法简便，适用于定性，但不适用于定量检测。

（2）放射性核素标记重组细胞因子（配体）的放射性受体分析：此法是检测细胞因子受体分布及其特性的主要方法，可测定受体的数量及亲和力。一般采用：①重组细胞因子体外标记放射性核素；②利用cDNA转录获得足够量的细胞因子mRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞内，在体外翻译的产物中加入放射性核素标记的氨基酸（如35S－蛋氨酸或3 H－亮氨酸等）。

（3）抗细胞因子受体单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）测定法：①McAb可封闭细胞因子受体（cytokine receptor， CKR），抑制相应细胞因子活性；②应用标记的McAb，可直接进行免疫放射受体分析或免疫沉淀试验。

（4）可溶性细胞因子受体的检测：体内已发现多种可溶性细胞因子受体（soluble cytokine receptor，sCKR），包括sIL－1R、sIL－2R、sIL－4R、sIL－5R、sIL－6R、sIL－7R、sG－CSFR、sGM－CSFR、sTNFR等。sCKR的检测一般采用免疫学方法，主要为双抗体夹心法和竞争结合法。