微生物的群体生长规律

对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规律因其种类不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物来说，在特定的环境中，不同种的微生物表现出趋势相近的生长动力学规律。

（一）单细胞微生物的生长曲线

如将少量单细胞微生物的纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线（growth curve，见图5-4）。

图5-4 单细胞微生物的生长曲线

（a）延滞期 （b）指数期 （c）稳定期 （d）衰亡期

从图5-4可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践上都有着十分重大的意义。

1.延迟期（lag phase）

当菌体被接入新鲜液体培养基后，在起初的一个培养阶段内，菌体体积增长较快，如巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的长度可以从3.4μm增长到9.1～19.8μm，胞内贮藏物质逐渐消耗，DNA与RNA含量也相应提高，各类诱导酶的合成量增加，此时细胞内的原生质比较均匀一致，但单位体积培养基中的菌体数量并未出现较大变化，曲线平缓。这一时期的细胞，正处于对新的理化环境的适应期，正在为下一阶段的快速生长与繁殖作生理与物质上的准备。在这一时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少数菌体开始分裂，曲线出现上升趋势。

延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养条件的不同而异，实践已知延滞期可从几分钟到几小时、几天甚至几个月不等。如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。同一种菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，营养和环境条件适宜，延滞期将显著缩短，甚至直接进入指数生长期。

在微生物发酵工业中，如果延迟期较长，则会导致污染机会增加、发酵设备的利用率降低、能耗水耗增加、产品生产成本上升，最终造成劳动生产力低下与经济效益下降。缩短延滞期可缩短发酵周期，提高经济效益。因此深入了解延滞期的形成机制，可为缩短延滞期提供指导实践的理论基础，这对于工业、农业、医学、环境微生物学及其应用等均有极为重要的意义。

在微生物应用实践中，通常可采取用处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、培养种子与下一步培养用的两种培养基的营养成分以及培养的其他理化条件尽可能保持一致等措施，可以有效地缩短延滞期。

2.指数生长期（exponential phase）

单细胞微生物的纯培养物在被接种到新鲜培养基后，经过一段时间的适应，即进入生长速度相对恒定的快速生长与繁殖期，处于这一时期的单细胞微生物，其细胞按20→21→22→23→24……2n的方式呈几何级数增长，这里的指数“n”为细胞分裂的次数或增殖的代数，也即一个细菌繁殖n代产生2n个子代菌体。这一细胞增长以指数式进行的快速生长繁殖期称为指数期，也称指数期（logarithmic phase）（见图5-4b）。

由此可见，培养基中细胞的最初个数和指数式生长一段时间后的细胞个数之间存在如下关系：

N＝N0·2n

式中：

N＝细胞最终数目；

N0＝细胞初始数目；

n＝指数生长期细胞繁殖代数。

细胞每分裂一次所需要的时间称为代时（generationtime），以符号G表示，G＝t／n。t是指数生长期时间，可从细胞最终数目（N）时的培养时间t2，减去细胞初始数目（N0）时的培养时间t1而求得（见下式与图5-5）：

t＝t2－t1

因此，如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数，就可以计算出n，为从N＝N02n中解出n，可对上式作如下变换：

N＝N02n

lg N＝lg N0＋nlg2

lg N－lg N0＝nlg2

从上式可见，n作为一个度量单位，可用来计算N、N0和代时G。

有关n和t的概念，可用于计算在不同培养条件下不同微生物的G，是研究微生物生长动力学的重要参数。

根据n、t，可以算出代时G。

在指数生长期中，细胞代谢活性最强，生长最为旺盛。从上式可以看出，在一定时间内菌体细胞分裂次数（n）愈多，代时（G）愈短，则分裂速度愈快。另外还可用生长速率常数（growth rate constant），即每小时分裂次数（R）来描述细胞生长繁殖速率。

图5-5 生长曲线的指数期

从上式可知，R的倒数（1／R）即为代时（G）。

处于指数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用指数期的菌体作种子，它可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。指数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。

指数生长期的生长速率受到环境条件（培养基的组分、培养温度、pH值与渗透压等）的影响，也是在特定条件下微生物菌株遗传特性的反映。总的来说，原核微生物细胞的生长速率要快于真核微生物细胞，形态较小的真核微生物要快于形态较大的真核微生物。不同种类的细菌，在同一生长条件下，代时不同；同一种细菌，在不同生长条件下，代时也有差异。但是，在一定条件下，各种细菌的代时是相对稳定的，有的20～30min，有的几小时甚至几十小时。表5-1列出了有代表性的微生物的相对代时（G）。

表5-1 某些微生物的生长代时

3.稳定生长期（stationary phase）

根据单细胞微生物指数生长规律，一个细菌如E.coli细胞的重量大约只有10－12g，但不难计算，如果其代时为20min，在指数生长48h后，所产生的细胞总量将会比地球还要重4000倍！这是不可思议的，事实上难以得到这样的结果。因为在这一时段内，一定存在某些因素抑制菌体的生长与繁殖。一般而言，制约对数生长的主要因素有：① 培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生长的需要而成为生长限制因子（growth-limited factor）；② 细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长；③ 由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，如营养物质比例的失调、pH、氧化还原电位的变化等。虽然这些因素不一定同时出现，但只要其中一个因素存在，细胞生长速率就会降低，这些影响生长因子的综合作用，致使群体生长逐渐进入新增细胞与逐步衰老死亡细胞在数量上趋于相对平衡状态，这就是群体生长的稳定期（见图5-4c）。

在稳定期，细胞的净数量不会发生较大波动，生长速率常数（R）基本上等于零。此时细胞生长缓慢或停止，有的甚至衰亡，但细胞包括能量代谢和一系列其他生化反应的许多功能仍在继续。

处于稳定期的细胞，其胞内开始积累贮藏物质，如肝糖原、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。稳定生长期时活菌数达到最高水平，如果为了获得大量活菌体，就应在此阶段收获。在稳定期，代谢产物的积累开始增多，逐渐趋向高峰。某些产抗生素的微生物，在稳定期后期时大量形成抗生素。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施来延长稳定生长期，以积累更多的代谢产物。

4.衰亡期（decline phase或death phase）

一个达到稳定生长期的微生物群体，随着培养时间的延长，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致死亡菌数逐渐超过新生菌数，群体中活菌数下降，曲线下滑（见图5-4d）。在衰亡期的菌体细胞形状和大小出现异常，呈多形态，或畸形，有的胞内多液泡，有的革兰氏染色结果发生改变等。许多胞内的代谢产物和胞内酶向外释放等。

微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中（如培养基、试管、摇瓶、发酵罐）生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物质和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可用作调控微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。

通过对微生物生长曲线的分析可见：① 微生物在指数生长期的生长速率最快。 ② 营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。 ③ 用活力旺盛的指数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，提早进入指数生长期。④ 补充营养物，调节因生长而改变了环境pH、氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长指数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。 ⑤ 指数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。