微生物生长量的测定

微生物学研究中常常要进行微生物生长量的测定。有多种方法可用于微生物生长量的测定，概括起来常用的有以下几种：

（一）直接计数法（又称全数法）

1.计数器直接测数法

取定量稀释的单细胞培养物悬液放置在血球计数板（细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等）或细菌计数板（适用于细胞个体形态较小的细菌）上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供测样品的细胞数。

（1）血球计数板及细胞计数

血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。在划有格子的区域中，有分别用双线和单线分隔而成的方格。其中有以双线为界划成的方格25（或16）格，这种以双线为界的格子称为中格（见图5-10），其内有以单线为界的16（或25）小格。因此，用于细胞计数的区域的总小格数为：25×16＝400。

图5-10 血球计数板方格示意图

该400个小格排成一正方形的大方格，此大方格的每条边的边长为1mm，故400个小格的总面积为1mm2。

在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有0.1mm高度的空隙。含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中。加注在400个小格（1mm2）之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为：

1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3

一般表示样品细胞浓度的单位为亿个／mL。因此，在计数后，获得在400个小格中的细胞总数，再乘以104，以换算成每mL所含细胞数。其计算公式如下：

菌液的含菌数／mL ＝ 每小格平均菌数×400×10000×稀释倍数

在进行具体操作时，一般取5个中格进行计数，取格的方法一般有两种：① 取计数板斜角线相连的5个中格；② 取计数板4个角上的4个中格和计数板正中央的1个中格。对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格4条边中的2条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计。取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。

（2）细菌计数板及细胞计数

细菌计数板与血球计数板结构大同小异，只是刻有格子的计数板平面与盖玻片之间的空隙高度仅0.02mm。因此，计算方法稍有差异（见以下计算公式），余与血球计数板法同。

菌液样本的含菌数／mL＝每小格平均菌数×400×50000×稀释倍数

2.涂片染色计数

用计数板附带的0.01mL吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置于刻有1cm2面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在1cm2面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野进行细胞计数。根据计算出的视野面积核算出每1cm2中的菌数，然后按1cm2面积上的菌液量和稀释度，计算每mL原液中的含菌数。

原菌液的含菌数／mL＝视野中的平均菌数×1cm2／视野面积×100×稀释倍数

3.比浊法

这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度（或透光度）或浊度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。一般在用此法测定细胞浓度时，应先用计数法作对应计数，取得经验数据，并制作菌数对OD值的标准曲线方便查获菌数值。

（二）活菌计数法（又叫间接计数法）

活菌计数法又称间接计数法。直接计数法测定到的是死、活细胞总数，而间接计数法测得的仅是活菌数。因此后者所得的数值往往比前者测得的数值小。

1.平板菌落计数

此法是基于每一个分散的活细胞在适宜的培养基中具有生长繁殖并形成一个菌落的能力，因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。

将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，将一定浓度的稀释液定量地接种到琼脂平板培养基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，可以计算出供测样品中的活细胞数。但应注意，由于各种原因，平板上的单个菌落可能并不是由一个菌体细胞形成的，因此在表达单位样品含菌数时，可用单位样品中形成的菌落单位来表示，即CFU／mL或CFU／g（CFU即colony-forming unit）。

2.液体稀释最大或然数法测数

取定量（1mL）的单细胞微生物悬液，用培养液作定量10倍系列稀释，重复3～5次，将不同稀释度的系列稀释管置于适宜温度下培养。在稀释度合适的前提下，在菌浓度相对较高的稀释管内均出现菌生长，而自某个稀释度较高的稀释管开始至稀释度更高的稀释管中均不出现菌生长，按稀释度自低到高的顺序，把最后三个出现菌生长的稀释管之稀释度称为临界级数。由3～5次重复的连续三级临界级数获得指数，查相应重复的最大或然数（即most proba-ble number，MPN）表求得最大可能数，再乘以出现生长的临界级数的最低稀释度，即可测得比较可靠的样品活菌浓度。

3.薄膜过滤计数法

测定水与空气中的活菌数量时，由于含菌浓度低，则可先将待测样品（一定体积的水或空气）通过微孔薄膜（如硝化纤维薄膜）过滤浓缩，然后把滤膜放在适当的固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。

（三）细胞物质量测定法

1.干重法

定量培养物用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离出来，洗净、烘干至恒重后称重，求得培养物中的细胞干重。一般细菌干重约为湿重的20％ ～25％ 。此法直接而又可靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含非菌体的干物质。

2.含氮量测定法

细胞的蛋白质含量是比较稳定的，可以从蛋白质含量的测定求出细胞物质量。一般细菌的含氮量约为原生质干重的14％ 。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：

蛋白质总量＝含氮量百分比×6.25

3.DNA测定法

这种方法是基于DNA与DABA-2HCl（20％ 3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液，W／W）结合能显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬液的荧光反应强度，求得DNA的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据DNA含量计算出细菌的数量，每个细菌平均含8.4×10－5ng DNA。

4.其他生理指标测定法

微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质。因此也可以用某物质的消耗量或某产物的形成量来表示微生物的生长量。例如通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或CO2的释放量，均可用来作为生长指标。使用这一方法时，必须注意作为生长指标的那些生理活动应不受外界其他因素的影响或干扰，以便获得准确的结果。