细菌生长曲线的测定

实验九　细菌生长曲线的测定

一、实验目的

（1）了解细菌的生长特点及其生长的测定原理。

（2）学习用比浊法测定细菌生长曲线的操作方法。

二、实验原理

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，作出的曲线叫生长曲线。依据其生长速率的不同，一般可把细菌生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。不同的微生物具有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解该菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

图9－1　单细胞微生物的典型生长曲线^[1]

测定微生物生长的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、干重法、比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与其光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液中微生物的浓度。将所测得的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。

三、实验器材

（一）菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）。

（二）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基。

（三）仪器和器具

721型分光光度计、比色杯、恒温摇床、无菌吸管、试管、三角瓶。

四、实验步骤

（一）种子液制备

取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取2环菌苔，接入盛有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，于37℃摇床振荡培养10～12h作种子培养液。

（二）标记编号

取盛有50mL无菌牛肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶11个，分别编号为0、1．5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。

（三）接种培养

用2mL无菌吸管分别准确吸取2mL种子液加入已编号的11个三角瓶中，于37℃下振荡培养（振荡频率250r／min）。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时同时测定OD值。

（四）生长量测定

以未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从最早取出的培养液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0．10～0．65以内，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即是培养液的实际OD值。

注意：测定OD值前，将待测定的培养液进行振荡，使细胞分布均匀。

如条件具备，本实验也可采用如下方法：

（1）用1mL无菌吸管吸取0．25mL大肠杆菌种子液转入盛有5mL培养液的试管中或是吸取2mL种子液到盛有50mL培养液的带侧臂试管的三角瓶中，混匀后将试管或三角瓶的侧臂直接插入分光光度计（特制）的比色槽中，比色槽上方用自制的暗盒将试管或三角瓶及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有培养液但没有接种的试管作为空白对照，测定样品培养0h的OD值。测定完成后，取出试管或三角瓶置37℃下继续振荡培养。

（2）分别在培养1．5，3，4，6，8，10，12，14，16，20h，取出培养物试管或三角瓶按上述方法测定OD值。该方法准确度高，操作简便，有条件的实验室可以采用。

五、实验记录

（1）将测定的OD值填入下表：

（2）以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。

六、思考题

（1）为什么说用比浊法测定的细菌生长只是表示细菌的相对生长状况？

（2）在细菌生长曲线中为什么会出现稳定期和衰亡期？在生产实践中怎样缩短延滞期？怎样延长对数期及稳定期？

参考文献

［1］朱旭芬．现代微生物学实验技术［M］．杭州：浙江大学出版社，2011．

［2］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．

［3］周德庆．微生物学实验教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2006．

【注释】

[1]引自周德庆：《微生物学教程》第3版，高等教育出版社。