细胞计数与生长曲线

在掌握细胞是否污染、细胞生长状态、培养液是否需要更新等简单观察的基础上，往往需要对细胞做进一步的生物学性状检测，了解细胞活力、增殖状况和分子表达等内容，研究的目的不同，采用的检查方法也不同，因此需要选择合适的指标来反映细胞的特殊性状。

一、细胞的形态学观察

每种细胞都有特定的形态特征，形态学观察有助于确定细胞的基本特征，观察手段有显微和超微两个层次，对象可以是活细胞、死细胞。

1．显微镜形态学观察 除前面述及的活细胞相差显微镜观察并摄影记录外。Giemsa染色或其他染色方法，可以快速简便地观察固定死细胞的形态。观察的主要内容有：①细胞类型归属，是上皮细胞还是成纤维型细胞；②细胞的一般形态，如细胞形状、大小、核质比例、染色质和核仁大小及多少等。应注意的是，培养细胞形态并非可靠的指标，它与细胞的数量多少及密度有关，单个游走细胞为不规则形，不好确定类型，细胞数量增多连成片后，可呈上皮型或成纤维型；注意细胞可因pH和温度等变化而发生形态改变对分析产生影响。

2．电镜超微结构观察 扫描电镜可以观察细胞膜的一些结构，如微绒毛的形态、多少，透射电镜可观察到细胞器的情况，如桥粒、微管、微丝、黑素小体、角质颗粒等。

二、细胞增殖生长状况

培养的细胞增殖生长力如何，能够传多少代，能否培养出研究所需的相应数量级的细胞量，是每个研究者关心的重要环节。细胞增殖生长力是判定细胞活力的重要指标，目前常用以下方法进行检测。

1．活细胞计数法 活细胞计数法是测定细胞绝对增长数值常用的最简便方法。常采用台盼蓝染色血细胞记数板记数法和电子细胞自动仪计数法。

2．细胞生长曲线 可以反映细胞的基本生长情况。测定方法是将细胞按一定的接种浓度接种到培养板上，然后在CO2培养箱培养，按一定的时间间隔（一般是1或2d）计数细胞，便可绘制出细胞生长曲线。具体程序为：①制备细胞悬液。按常规方法制备细胞悬液，并计数。②接种细胞。向每孔中接种等量细胞和等量的培养基，置温箱中培养。③细胞的计数和检测。按照实验设计要求，在相应时相点计数每一组中每孔的细胞总数，取3个孔的均值。④绘图。在Excel中输入数据后，在制表项中绘制出曲线。本法简便易行，但不够精确，可以采用多次计数求均值的方法以减少误差。细胞总量增加1倍的时间称倍增时间，绘出细胞生长曲线后则可以直接从曲线中测知。

由于活细胞计数较麻烦，准确性较差，因此目前通常采用MTT染色法来绘制细胞生长曲线，也可以用来制作细胞数量的标准曲线。其原理是：细胞线粒体脱氢酶能将MTT氧化成稳定的甲（formazan），然后用二甲亚砜或酸化异丙醇溶解，通过测定光密度来反映细胞活力，MTT法很好地反映细胞的能量代谢与细胞数量的线性关系。其方法是将细胞接种到24板孔中，在培养箱中培养一定时间，在设计的时相点上加入5mg／ml MTT的PBS 1ml，37℃培养45min，吸净PBS，用0．01mol／L PBS洗2次，加入1ml DMSO充分溶解甲，每孔吸100μl到96孔板，用酶联检测仪在波长为570nm处测定OD值。由于酚红、血清、人血白蛋白、免疫球蛋白等会产生假阳性，应同时做无细胞对照。制作细胞数量标准曲线是按设计要求，接种不同数量的细胞，培养4h，然后用MTT反应，便可测得不同细胞量的OD值，然后绘制曲线。

3．细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标，为检测细胞群每1 000个细胞中所含的分裂细胞数（分裂细胞／1 000）。计数公式为，细胞分裂指数＝（细胞分裂相数／1 000个细胞）×100。分析细胞分裂指数需用固定标本以防止观察到活细胞中细胞分裂。

4．接种存活率和克隆形成率 是表示细胞群活力的重要指标。将细胞制成单细胞悬液后，以低密度（2～5个／cm2）接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值称接种存活率。由于检测接种存活率时是借观察克隆（通常为16～50个细胞）形成情况，又因每个克隆都来自一个细胞，因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比。细胞接种存活率＝（形成克隆数／接种细胞数）×100。

对经过冻存复苏的细胞，其接种后再培养时，常测定细胞接种率（也称贴壁率），即接种后细胞能够贴壁的数量。细胞接种率＝（贴壁存活细胞数／接种细胞数）×100。细胞接种率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，表明细胞是活的，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，因此细胞接种率和细胞接种存活率在概念上是不相同的。而接种存活率与克隆形成率意义相同，但克隆形成率概念更明确、更准确。

克隆形成率受许多因素影响，从条件来说与底物、培养液、血清的质量及有无杂质污染等有关；也受温度和pH的影响。从细胞方面来看，与细胞的种类、增殖能力、代次等密切相关，克隆形成率能够反映细胞的2个重要性状，即群体依赖性和增殖能力。一般初代培养细胞低，传代细胞系高；二倍体细胞低，转化细胞系高；正常细胞低，肿瘤细胞高。即随细胞生物学性状的不同，细胞克隆形成率差别很大；另外所有细胞的克隆形成率又受细胞接种密度的影响。

冻存技术不良或细胞活力差时可降低接种存活率。为得到确切的接种存活率，接种时一定要接种分散为单细胞的悬液。一般情况下，把细胞直接接种在培养板中即可。

5．流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成 流式细胞仪已成为检测细胞增殖周期的主要手段，可以检测细胞周期时相、DNA合成强度、持续时间等，效果很好，且步骤简单、快捷，结果准确，已取代了应用放射性核素等繁琐方法。培养的细胞是流式细胞仪最适合检测的对象。