蒸馏水的氧化还原电位是多少

1. 修改的Marklund法(即邻苯三酚自氧化法)(GB/T5009.171—2003第一法)

1)原理

在碱性条件下，邻苯三酚会发生自动氧化，释放出O-2，生成带色的中间产物。SOD能催化下述反应:

从而阻止了中间产物的积累，可以根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。

2)仪器

①紫外可见分光光度计;

②精密酸度计，精确度0.01;

③离心机;

④玻璃乳钵。

3)试剂

①A液: p H8.200.1mol/L三羟基氨基甲烷(Tris) -盐酸缓冲溶液(内含1 mmol/L EDTA·2Na)。称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4m L0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100m L。

②B液: 4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100m L。

③10mmol/L盐酸溶液。

④0.200mg/m L超氧化物歧化酶(SOD)。

4)操作步骤

(1)试样的制备

①固体样品(茶、花粉等)称取1.00g置于玻璃乳钵中，加入9.0m L蒸馏水研磨5min，移入10m L离心管，用少量蒸馏水冲洗乳钵，洗涤并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000 r/min离心15min，取上清液测定。

②澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品经4000r/min离心15min，再取上清液测定。

(2)测定

①邻苯三酚自氧化速率测定: 在25℃左右，于10m L比色管中依次加入A液2.35m L，蒸馏水2.00m L，B液0.15m L。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。本实验确定ΔA325(min-1)为0.060。

②样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按上述步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)，即ΔA'325(min-1)为0.030。

SOD活性测定加样程序见表13-3。

表13－3 SOD活性测定加样表

5)结果计算

(1)液体样品按下式计算

式中: U/m L——SOD活力单位;

ΔA325——邻苯三酚自氧化速率;

ΔA'325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;

V——所加酶液或样液体积，m L;

D——酶液或样液的稀释倍数;

4.5——反应液总体积，m L。

(2)固体样品按下式计算

式中: V——所加酶液或样液体积，m L;

ΔA325——邻苯三酚自氧化速率;

ΔA'325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;

D——酶液或样液的稀释倍数;

4.5——反应液总体积，m L;

V1——样液总体积，m L;

m——样品质量，g。

2.化学发光法(GB/T5009.171—2003第二法)

1)原理

SOD能够催化下述反应:

在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶可催化黄嘌呤(或次黄嘌呤)氧化转变成尿酸，在该反应过程中同时产生O-2。O-2可与鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)进一步作用，使发光剂鲁米诺被激发，而当其重新回到基态时，则向外发光。由于SOD可消除O-2，所以能抑制鲁米诺的发光。通过该反应过程，以空白对照的发光强度值为100%，通过加入SOD后抑制发光的程度进行SOD活性的测定。

2)仪器

生化化学发光仪。

3)试剂

①0.05mol/L碳酸盐缓冲液(p H10.2)

a.0.1mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液: 称取碳酸钠(A.R.)10.599g用蒸馏水溶解并定容至1000m L。

b.0.1mol/L碳酸氢钠(Na HCO3)溶液: 称取碳酸氢钠(A.R.)8.401g，用蒸馏水溶解并定容至1000m L。

c.0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(p H10.2): 将0.1mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液和0.1mol/L碳酸氢钠(Na HCO3)溶液按6:4比例混合。

d. 0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(p H10.2): 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液与蒸馏水按1 1比例混合。

②0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠(内含0.1mmol/LEDTA·2Na)缓冲液(p H10.2): 称取37.2mg EDTA·2Na用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液溶解并定容至1000m L。

③0.1mmol/L鲁米诺溶液(Luminol): 称取3.54mg鲁米诺，用蒸馏水溶解并定容至200 m L。

④0.1mmol/L次黄嘌呤溶液(HX): 称取2.76mg HX，用蒸馏水溶解并定容至200m L。

⑤0.1mmol/L黄嘌呤氧化酶(XO): 称取0.1mg XO用含0.1mmol/LEDTA·2Na的0.05mol/L碳酸盐缓冲液定容至1.0m L。

⑥0.001mg/m L超氧化物歧化酶(SOD): 精密称取0.1mg SOD，用含0.1mmol/LEDTA ·2Na的0.05mol/L碳酸盐缓冲液定容至100m L。

⑦HX-L液: 0.1mmol/L次黄嘌呤溶液(HX)与0.1mmol/L鲁米诺溶液1 1混合(临用时混合)。

4)操作步骤

(1)试样的制备

同修改的Marklund法中试样的制备。只是固体样品用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠(内含0.1mmol/LEDTA·2Na)缓冲液代替蒸馏水。

(2)绘制抑制发光曲线

操作程序见图13-9和表13-4。

图13－9 SOD抑制化学发光曲线

表13－4 SOD抑制化学发光曲线制作步骤

(3)测定SOD活性

测定样品相对发光强度，计算抑制发光率，并查SOD抑制发光曲线，得SOD量(mg)。

5)结果计算

(1)液体样品按式(13-18)计算

式中: m1——查抑制曲线中SOD量，ng;

V——取样液体积，m L;

3.5——标准SOD抑制50%发光时的SOD浓度，ng/m L;

3300——SOD标准比活力，U/mg蛋白;

C50——SOD酶液抑制50%化学发光率时的SOD浓度，单位为ng/m L;

D——样液的稀释倍数。

(2)固体样品按式(13-19)计算

式中: m1——查抑制曲线中SOD量，ng;

m——样品质量，g;

V——样液总体积，m L;

V1——取样液体积，m L;

3.5——标准SOD抑制50%发光时的SOD浓度，ng/m L;

3300——SOD标准比活力，U/mg蛋白;

C50——SOD酶液抑制50%化学发光率时的SOD浓度，单位为ng/m L;

D——样液的稀释倍数。