枸杞小孢子发生与发育的超微结构特点

3.5　枸杞小孢子发生与发育的超微结构特点

孢原细胞至次生造孢细胞时期雄蕊原基形成后，由于原基的四个角隅处细胞分裂较快，使得花药逐渐呈四棱状。接着在花药的4个角隅处，紧靠原表皮下分别分化出了1个大形细胞——孢原细胞。孢原细胞及其细胞核均较周围细胞大，形态上较容易与花药原基中的其他细胞区分。电镜下观察，其细胞质中有一些含絮状物的小液泡，但线粒体和质体的形态不易区分。之后，有的孢原细胞向两侧分化，使得原表皮内分化出1排排列整齐的孢原细胞，然后这排孢原细胞进行平周分裂，向外分裂、分化形成1排初生壁细胞，向内分裂、分化形成1排初生造孢细胞，二者的细胞质没有明显差异，均分化出了质体，但质体仍无片层结构。初生壁细胞经过分裂分化形成了药壁的各细胞层。初生造孢细胞经过1次分裂，分化形成了2层次生造孢细胞，这样形成的次生造孢细胞排列较整齐；而有的孢原细胞直接分裂，形成内外排列的初生造孢细胞和初生壁细胞。初生造孢细胞和初生壁细胞分别向两侧分化以增加其细胞数量，同时二者再经分裂，分别形成药壁的各个细胞层和次生造孢细胞。这样形成的次生造孢细胞排列较不规则。次生造孢细胞的细胞质致密，含有较多不同形态的质体及线粒体，且细胞之间胞间连丝较丰富。

随后次生造孢细胞的原生质向细胞内凹陷，在细胞壁内侧形成了大量的内陷小液泡，同时，在紧贴细胞壁的内侧出现了少量胼胝质的沉积，而其细胞质中出现了较多的粗糙内质网（见图3-6）。

小孢子母细胞时期枸杞花药次生造孢细胞进入小孢子母细胞的标志为在细胞壁与质膜之间出现胼胝质壁。

次生造孢细胞细胞壁内侧形成了大量的内陷小液泡后，紧接着紧贴细胞壁的内侧出现了少量胼胝质的沉积，表明此时开始了小孢子母细胞的分化，次生造孢细胞进入到了小孢子母细胞阶段。之后，这些内陷小液泡彼此结合、增大，波浪状分布于细胞壁的内方。在此期间，小孢子母细胞细胞核内染色质凝缩，细胞质中核糖体、粗糙内质网、质体和线粒体非常丰富，并且细胞之间具有较多的胞间连丝，有些细胞中还出现了染色质穿壁现象。说明小孢子母细胞仍在进行着细胞分裂，增加其细胞数量，并且细胞代谢较旺盛。随后，在小孢子母细胞细胞壁的内侧液泡迅速增多并汇聚，形成了较宽的“液泡环”，将其细胞质挤向细胞中央。同时可以看，到小孢子母细胞的原生质在通过“液泡环”向细胞壁内侧分泌并添加大量的胼胝质物质（见图3-7）。

小孢子母细胞开始积累胼胝质壁时，首先发生在靠近绒毡层和花粉囊腔中央的有空隙部位的细胞角隅处。之后胼胝质壁的沉积开始向小孢子母细胞的内、外切向壁内延伸、增厚，推测小孢子母细胞时期形成的大“液泡环”可能直接与胼胝质物质的合成有关。与此同时，在小孢子母细胞的胞质

图3-6　孢原细胞发生及次生造孢细胞发育和特点

图3-7　小孢子母细胞胼胝质壁的发生

中出现了许多线粒体、质体及各种不同形态膨大的内质网小泡。当胼胝质壁增加到一定程度时，小孢子母细胞的“液泡环”开始逐渐减少、变薄，而在此期间胼胝质壁仍然在继续增厚，且细胞质电子密度增加，细胞与细胞间可见大量较宽的胞质通道——胞间道。在胞间道中以及两侧时常可以看到较大的包含有细胞器的细胞质流，甚至包含有核染色质的核质流在相邻细胞间流动（见图3-8）。前人研究认为，胞间道是胞间连丝通道的增宽，仍然属于胞间连丝范畴，是一种特殊形式的胞间物质和信息联系的通道，常常在不同种植物的小孢子母细胞期间观察到。小孢子母细胞之间这种物质与信息的交流，加强了同一药室内的小孢子母细胞之间发育的同步性。

这些现象暗示着小孢子母细胞即将发生较大的变化。

在花药药室（花粉囊囊腔）增大过程中，小孢子母细胞彼此分开，游离于药室中。此时，小孢子母细胞的胞质浓厚，核糖体、粗糙内质网非常丰富，常常可以看到成堆分布的巨大内质网堆。当液泡环带渐渐消失时，小孢子母细胞已被厚厚的胼胝质壁包被。此时，母细胞胞质核糖体密度增加，线粒体和质体数量增多，但是质体仍未发育出片层结构，有的母细胞间仍然可见胞质通道。之后，母细胞间的这种胞质通道消失，细胞进入减数分裂阶段。在枸杞小孢子母细胞减数分裂早期，首次发现在小孢子母细胞的胼胝质壁内方再次出现了较大程度的液泡化现象，各种大小不等的液泡分布于原生质体的边缘，将母细胞的细胞核及细胞质挤向细胞中央。这时，母细胞的细胞质仍旧浓厚，含有丰富线粒体、内质网及内质网形成的小泡。当这些液泡再次融合形成了液泡环后，小孢子母细胞的原生质体与胼胝质壁分开。稍后，小孢子母细胞的内质网小泡减少，但在细胞质中分布有较多的线粒体、质体和高尔基体等。推测，此时的大液泡一方面是为减数分裂制造一个很狭小的空间，以便于分裂过程中营养及能量供应的快捷；一方面在液泡中大量合成和储存胼胝质物质，为即将形成的用于四分孢子分割的胼胝质壁做着准备工作，同时母细胞的体积又得到了进一步扩大。

在整个减数分裂期期间，小孢子母细胞发生了细胞质退化现象，核糖体急剧减少，线粒体降解膜内嵴消失，质体减少并且形态变小。而且，核内形成了较大的核液泡，致使核内染色体等核物质被相对集中于较小范围内。第一次分裂结束后，两个核之间没有形成细胞壁，紧接着又进行了第二次分裂，所以，枸杞小孢子母细胞减数分裂为同时型（见图3-9）。分裂结束后，细胞核糖体迅速增加，线粒体结构开始恢复。由于第二次分裂的赤道面与前一次不在同一个平面，并且分裂过程较迅速，减数分裂结束后形成了4个核，之后在其质膜形成过程中，外面包裹的胼胝质壁由外向内渐渐将4个四分孢子分割开来，形成了具有四面体形的四分体。

图3-8　小孢子母细胞特点及其核质穿壁现象

图3-9　小孢子母细胞减数分裂期间的“核液泡化”与“胞质改组”现象

四分体时期四分体形成后，每一个四分小孢子都被厚厚的胼胝质壁所包裹，并且四分孢子的胞质浓厚，核糖体密度大，线粒体和质体等细胞器丰富，结构完整。随后，四分孢子出现了很多由光滑内质网形成的小泡。同时，在胼胝质壁与质膜之间形成了一层较厚的絮状物。这层结构就是花粉的原外壁原基。随着四分孢子的发育，小泡消失，线粒体增多，并且，在花粉原外壁原基中间逐渐分化出不连续的条带——基粒棒。随即在基粒棒的上端横向扩展，形成了覆盖层（见图3-10）。同时，由于平行于质膜的内质网的存在，这时萌发孔的界限已分清，在萌发孔区没有花粉原外壁。到四分体胼胝质壁开始降解、四分孢子即将从胼胝质壁内释放出来时，基足层已横向贯通形成。因此，枸杞花粉同大多数花粉一样，花粉原外壁是在四分体中分化形成的。同时，由于胼胝质壁的限制，体积增大的四分孢子表面皱褶，细胞质依然浓厚，核糖体、线粒体丰富。四分体末期，四分体外侧的胼胝质壁在绒毡层分泌的胼胝质酶的作用下首先减薄、消失，这样四分孢子就从这些胼胝质壁缺口处游离出来，形成了单核小孢子，而留下的胼胝质壁最终完全被胼胝质酶降解、消失。

小孢子早期刚游离出来的小孢子，细胞核位于中央，细胞器丰富，特别是线粒体非常多。由于花粉萌发孔在四分体中就已预定，当小孢子游离出来后，可以看到在萌发孔部位的花粉外壁是不连续的，其中有些黑色囊泡状颗粒物。在萌发孔以外的其他部位，花粉外壁外层分化形成，呈现出明显的三层结构，最外面的覆盖层较厚，基粒棒层的电子密度较低，基足层较薄，在外壁外层中迅速沉积由绒毡层分泌来的孢粉素，与此同时，随着小孢子的释放，外壁内层，以及内壁迅速同时开始发育。据观察，内壁的生长同高尔基体的活动有关（见图3-11）。

小孢子液泡化时期小孢子继续发育，在外壁外层的内方很快分化出了花粉外壁的内层。外壁内层的电子密度要比外壁外层明显高，与外壁外层的基足层紧密贴合，并且在萌发孔部位较厚，而外壁外层中继续大量沉积由绒毡层分泌来的孢粉素。此时，在小孢子的细胞质中出现了少量的小液泡，线粒体仍然很丰富。随后，花粉萌发孔部位变宽，并且可清楚地看出此处的花粉外壁不连续，同时外壁内层也呈现出多层的片状结构。随着小孢子的发育，液泡增多，并融合增大，核糖体和线粒体数量下降，并且外壁的内外层加厚，随后，质体出现肿胀、退化现象（见图3-12）。

图3-10　四分体特点及花粉原外壁原基的发生

图3-11　四分体胼胝质壁降解过程与早期小孢子细胞结构特点

小孢子液泡化后期在细胞中形成了一个体积硕大的大液泡，其体积超过了整个细胞体积的一半。由于大液泡的形成，细胞质和细胞核被挤到了细胞的边缘区域，使小孢子具有了明显的极性。此时，在花粉萌发孔的外壁内层下面，出现了一个由许多分泌小泡聚合后形成的、电子密度较低的区域——胞质囊区，在其外方的花粉外壁内层仍然呈不连续的多层结构，而花粉外壁的覆盖层上继续沉积绒毡层细胞的降解物，这时，花粉内壁开始形成（见图3-13）。

二胞花粉期间小孢子细胞核靠边后，大液泡随即开始收缩，细胞质电子密度增加，新出现了许多的多聚核糖体，线粒体和质体结构恢复正常，细胞核的周围开始出现淀粉粒。表明小孢子细胞质再次分化完成。此时，花粉的内壁仍在合成中，在外壁的表面上继续沉积绒毡层细胞的降解物。之后，小孢子开始进行了配子体发育的第一次有丝分裂。这次分裂为不对称分裂，结果形成了大小不等的两个细胞：小细胞为生殖细胞，呈透镜状紧贴着正在形成的花粉内壁，而大细胞为营养细胞，它继承了小孢子的大部分细胞质物质。生殖细胞的细胞核大，细胞质较少，有线粒体、内质网和液泡等细胞器，但没有质体。而营养细胞核的周围，分布着较多的线粒体、内质网和质体，淀粉粒的数量开始增多。另外，分隔生殖细胞与营养细胞的壁为胼胝质性质的壁，其上具有很多胞间连丝，并且这层壁的侧面与正在形成的花粉内壁相连（见图3-13）。之后，生殖细胞逐渐变圆，开始脱离花粉内壁向营养细胞中游离。期间，生殖细胞始终未见质体，而营养细胞中线粒体、内质网、质体、淀粉粒和脂滴渐渐增多，并且在生殖细胞周围分布有较多的粗糙内质网。最后生殖细胞完全脱离了花粉壁，游离在营养细胞中。当生殖细胞游离到营养细胞中后，两个姊妹细胞之间的分化也逐渐明显，尤其是生殖细胞核的染色质凝缩程度比营养细胞核高，形成了明显的对比。与此同时，营养细胞中的大液泡渐渐变小，而细胞核又重新移位到细胞的中央，细胞质中的脂滴、淀粉粒继续增加。此时，可以看到细胞质中的许多小液泡正在以胞吐的形式与花粉内壁融合。紧邻胞吐小泡的下方常可看到有较大的粗糙内质网（见图3-14）。说明构建花粉内壁的物质来源于小孢子胞质中的粗糙内质网。

图3-12　小孢子液泡化过程及在细胞中发生的“细胞质改组”现象

图3-13　小孢子的“细胞质改组”现象与早期二胞花粉

当营养细胞中的大液泡完全消失后，细胞质中的淀粉粒和脂滴等营养物质也明显增多。这时，萌发孔下方的胞质囊区也异常厚，在萌发孔处的花粉外壁仍然不连续，花粉外壁内层依然是多层结构，而营养细胞的细胞质中具有较多的粗糙内质网，尤其是在生殖细胞的周围。随后，萌发孔下方的胞质囊区逐渐收缩变小，营养细胞中的淀粉粒和脂滴越来越多，这个时期在营养细胞中还可见到巨大的内质网（见图3-15）。当胞质囊区完全消失时，花粉内壁也分化完成。此时，在萌发孔处的花粉内壁较厚，无花粉外壁结构，而营养细胞中脂滴和淀粉粒的含量达到顶峰，在电镜下这两种营养物质的电子密度不同，很容易区分。而生殖细胞和营养细胞的细胞核大多分布在花粉的中央，在生殖细胞的周围仍有较多的内质网环绕。

成熟花粉枸杞花粉属二细胞型花粉，到开花时，花粉仍由营养细胞和游离在营养细胞内的生殖细胞组成。生殖细胞常呈现出与营养核紧密相邻的状态。此时，营养细胞的细胞质致密，各种细胞器、脂滴和淀粉粒等丰富。生殖细胞的体积较小、呈梭形，横切面形状不规则，但细胞核大、细胞质少，其中含有结构完整的高尔基体、内质网和线粒体等细胞器。花粉外壁已经形成了其特有的外壁覆盖物及纹饰，内壁紧紧贴合在外壁内层的内侧，而且萌发孔处仅具有较厚的内壁（见图3-16）。

据研究，花粉内外壁都包含相当量的蛋白质。内壁蛋白质一般集中于萌发孔附近，外壁蛋白质存在于基粒棒间的腔隙中（具覆盖层的花粉），或者表面的凹陷处（无覆盖层的花粉）。这些蛋白质中部分是酶，其中大部分是水解酶。内壁蛋白质产生于花粉细胞质，所以是雄配子体的产物，而外壁蛋白质是绒毡层的产物，它来源于孢子体组织。

图3-14　二胞花粉发育过程中大液泡消失与营养物质的积累

图3-15　二胞花粉发育中期花粉的结构特点

图3-16　成熟花粉粒示营养细胞、生殖细胞及花粉壁结构特点