和基因突变

第二节　耐异烟肼与katG、inhA和ahpC基因突变

异烟肼（Isoniazid，INH）为最早合成的抗结核药，和RFP一样，是重要的一线抗结核药物。1952年，发现异烟肼具有强大的抗结核作用，至今仍是现有抗结核药物中抑菌作用最强的药物，这被认为是结核病治疗史上的一个里程碑。INH结构简单，仅由一个吡啶环和一个酰肼基团组成。目前各地报道的INH耐药率也呈上升趋势，然而其耐药机制却是所有抗菌药物中最为复杂的一个，至今尚未完全阐述清楚。

INH是前体药物，需要细菌通过体内代谢使其活化。细菌体内的过氧化氢—过氧化物酶不仅有助于促进INH进入菌体，而且还可以对INH加以化学修饰，使之具有生物活性，从而产生杀菌效应。早在20世纪50年代，就发现了INH耐药结核杆菌中过氧化氢—过氧化物酶活性丧失或降低的现象。以后，许多学者对该酶与INH耐药性的关系进行了大量研究。直到1992年，Zhang等克隆出过氧化氢—过氧化物酶编码基因（katG），并将这个基因转移到耐异烟肼的耻垢分支杆菌中，可以恢复该菌对INH的敏感性，从而证实了katG基因与INH耐药性之间的关系。katG基因的结构已经清楚，其处于上游furA基因和下游embC基因的一个功能区段。全长2223bp，G＋C含量为64.6%。 katG基因编码含血红素酶，即过氧化氢酶—过氧化物酶。其N端编码作用范围广的过氧化物酶，C端编码过氧化氢酶。此酶在细菌的氧化应激反应中起作用，广泛存在细菌中。很多细菌含有katG基因，与分枝杆菌katG基因有较高的同源性。在结核杆菌中，katG基因编码的过氧化氢酶—过氧化物酶能转化异烟肼成为毒性形式，这种活化的INH形式能与分枝杆菌分枝菌酸生化合成途径中的编码烯脂酰载体蛋白（enoyl-ACP）还原酶—NADH复合体结合，抑制其活性，进而干扰分枝菌酸合成，发挥抗菌作用。katG基因突变后，过氧化氢酶—过氧化物酶空间构型改变，活性降低或丧失，与异烟肼结合能力下降，阻止INH转换成活性形式，进而导致耐药性表型。

目前，国、内外通过PCR-SSCP和基因测序等分子生物学技术对大量临床菌株的katG进行了分析。结果表明，主要是katG基因的点突变与INH的耐药相关，其中，katG315位突变与INH耐药的相关性最为明确，在异烟肼耐药结核分枝杆菌临床分离株中，50%～70%出现点突变或部分缺失、插入等，最常见的点突变是315位Ser（AGC）→Thr（ACC），315位Ser被视为是决定酶活性的关键部位。其他还可见katG基因63位Asp、108位His、104位Arg、108位His、138位Asn、148位Leu、262位Thr、270位His、275位Thr 、312位Trp、350位Ala、381位Asp和629位Gly等密码子突变。目前也有报道指出，katG的一些突变不影响酶的活性。例如，先前一些文献都集中对katG基因中315位Ser和463位Arg突变作了报道，认为这两种突变和耐药性关系最密切。但近年来一些学者认为，463位Arg不影响酶活性，生化和流行病学资料也证实463位Arg→Leu的突变与INH耐药无关。

INH耐药性相关的另一个基因是inhA基因，由Banerjee等于1994年首先克隆出来。inhA基因全长810bp，编码enoyl-ACP还原酶，其上游是mabA基因，二者相距21bp，inhA和mabA基因共同组成一个操纵子，转录起始于mabA基因上游的启动子。inhA基因参与结核杆菌分枝菌酸的合成，编码产物是enoyl-ACP还原酶（InhA）。该酶在脂肪酸合成循环反应的最后一步起作用，将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，参与长链脂肪酸的延长，并进一步被分枝杆菌用于合成分枝菌酸，分枝菌酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是一种长链且带侧枝的脂肪酸（60～90个碳原子，能维持细菌菌体的完整性）。 INH通过抑制分枝菌酸的生物合成会引起一系列反应而导致细菌变形、分解并死亡。Rozwarski等（1998年）研究证实，InhA是活化的INH的原始靶位，INH特异地结合于InhA的辅助因子（NADH还原型辅酶Ⅰ），形成加和物，此加和物可共价结合于InhA的NADH结合位点，灭活InhA，产生杀菌作用。一旦InhA突变，InhA结构改变，导致InhA对NADH亲和力下降，即使异烟酰-NADH复合物已经形成，也难以影响InhA的酶活性，从而形成对异烟肼的耐药性。一些研究者报道了临床菌株中inhA的突变情况，但结果不尽一致。Basso等对异烟肼耐药菌株inhA进行了测序，发现5株inhA结构基因存在下列突变：Ile16Thr（ATC→ACC），I1e21Val（ATC→GTC），Ile47Thr（ATT→ACT），Val78Ala（GTG→GCG）和Ile95Pro（ATT→CCT），且不伴其他突变。在异烟肼敏感菌株中未发现这些氨基酸替换。但更多的研究报道显示，结核杆菌多为启动子区发生突变，突变率在10%左右，突变发生在位于mabA起始密码子上游的核糖体识别结合位点（RBS），突变造成转录上调，通过使InhA蛋白过量表达，造成细胞内InhA浓度增高，来抵抗INH的选择压力，导致耐药产生。

1996年，Wilson等报道了另一个与结核杆菌INH耐药性有关的基因，即ahpC基因。ahpC基因全长588bp，其编码烷基过氧化氢还原酶（AhpC），AhpC蛋白具有解除过氧化氢毒性的作用。Ferrari等（1999年）也报道结核杆菌可以抵抗宿主细胞内有毒成分——过氧化氢、超氧阴离子和单个氧分子等，而AhpC在其中发挥着重要作用。临床研究表明，在katG基因缺失的菌株中发现同时存在ahpC调节基因的突变，导致ahpC基因表达增加，这可能是菌体内丧失过氧化氢酶活性后的一种代偿性选择的结果。实验研究表明，将ahpC基因转入耐多药结核杆菌并不能恢复后者对结核杆菌的敏感性，提示ahpC基因可能对INH耐药不产生直接影响，但由于katG功能丧失往往伴随ahpC调节基因的突变所导致的AhpC表达上升，故它可作为监测INH耐药的一个有用指标。 Kelley等（1997年）利用克隆测序分析，发现在过氧化物酶阴性、katG基因变异的耐INH菌株，其ahpC基因调节序列启动子区域-6bp，-9bp，-10bp，-12bp，-30bp，-42bp处有C→T突变存在，并与转录的精确起始有关；但在过氧化物酶阳性、无katG基因变异的耐INH菌株，却未见序列的变异。也提示ahpC基因突变可不直接导致耐药，而仅作为katG基因突变的补充。