转基因猪问世前景诱人

1　转基因猪问世前景诱人

1982年，美国《细胞》杂志的封面刊登了两只小白鼠的照片，其中的一只比另一只大一倍多。这是美国科学家Palemiter领导的实验室，将大白鼠的生长激素基因与小白鼠的金属疏蛋白基因启动子相连接，然后显微注入到小白鼠的受精卵原核，得到的生长加快一倍的“巨型小鼠”。这个试验结果一公布，立即得到了科学家们的高度重视，因为它显示的基因工程改良动物生产性能的巨大潜力。很快，科学家们用类似的方法相继得到了基因工程猪、牛、羊、兔和鱼。基因是指存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位，人们把这种通过基因转移技术所获得的，携有外源基因的动物叫做“转基因动物”。

第一头转基因猪是美国科学家Hammer教授1985年得到的。他将人的生长激素基因注入猪的受精卵，得到了可以表达人生长激素的转基因猪。不久，Pursel领导的实验室又得到了表达牛生长激素的转基因猪。这种转基因猪的生长加快了15%。然而，异种生长激素在猪体内分泌的结果，导致转基因猪出现了较多的畸形、生殖能力和对环境的适应能力下降等一些不良作用。于是，人们设想在猪的基因组中插入、添加一段猪自身的生长激素基因，使猪自身的生长激素分泌量增加，达到提高生长速度而又减少不良作用的目的。基于这种设想，1989年我国北京农业大学陈永福教授和湖北省农科院魏庆信所领导的实验室合作，将猪的生长激素基因与绵羊的金属疏蛋白基因启动子连接，注射到湖北白猪的受精卵，得到了我国的第一批转基因猪。这批转基因猪已经遗传了5个世代，表现出生长加快10%～15%。饲料转化率提高5%～10%，而且不良作用大大减少。但是外源基因在传代的过程中出现了一部分被修饰，遗传还不很稳定，因此，要培育出一个转基因猪的品系或品种，推广应用到生产，还有一些问题需要研究解决。

在各国科学家的努力下，到20世纪末为止，已经有数十种外源基因被导入猪的基因组，获得了各种具有特殊专门性状的转基因猪。

(1)转基因猪的构建

转基因猪的构建需要现代的分子生物学技术、胚胎操作技术、猪的繁殖技术和育种技术的有机结合。大体可以分成以下3个步骤:

目的基因的制备想通过转基因技术改良猪的某个生产性状，或者赋予猪某种特殊的性状，首先必须制备外源目的基因。它至少应包括两部分:结构基因和调控序列。

结构基因是最终要在转基因猪中表达的部分。因此，也是最基本、最关键的部分。结构基因制备的方法有多种，例如限制内切酶法、化学合成法、分子杂交法、反转录酶法和聚合酶链式反应(PCR)、体外扩增法DNA(脱氧核糖核酸)。目前在真核生物中最常用的方法是反转录酶法和PCR法。

用反转录酶法制备目的基因，首先要分离出相应的mRNA(信使核糖核酸)。一个典型的哺乳动物细胞约含10^－5微克RNA(核糖核酸)，而其中mRNA仅占1%～5%，它们大小不同、序列各异、种类成百上千。然而在某些特异而高度分化的组织中，特异的mRNA所占比例比较大。例如:哺乳动物的生长激素是由脑垂体分泌的，脑垂体组织中生长激素的mRNA含量较高，易于提取。以脑垂体中提取的mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成具有生物活性的双链DNA，这就是生长激素的结构基因。PCR法制备结构基因，要在已知目的基因NDA序列的基础上，设计一对引物，以生物基因组的总NDA为底物，通过DNA体外扩增仪，就可以扩增出结构基因。

只有结构基因，还不能在猪细胞中表达。必须连有基因的调控序列。调控序列是控制结构基因开启与关闭的DNA片段。在转基因猪外源基因的制备中，人们常根据表达的需要选择不同种类的调控序列。

将上述两部分NDA片段通过DNA连接酶焊接在一起，就构成了我们所需要的重组基因。为了获得足够数量的重组基因，以备基因导入之用，还必须将重组基因与某一特定的载体相连接，然后进入细胞，通过细胞的增殖来实现重组基因的大量复制。人们发现的具有上述功能的载体主要有质粒、噬菌体和病毒，而质粒是目前应用比较普遍的载体，它是某些细菌中独立于染色体之外的环状DNA。首先将重组基因插入质粒，然后将质粒送回细胞(细菌)中。在一定的环境和培养基中，细菌细胞大量增殖，质粒也就随之大复制。达到一定的数量之后，将质粒从细菌中提取出来，再用限制内切酶将环状的质粒切成线性并加以修饰，用一定的溶剂配置成2微克/毫升的基因溶液，用于显微注射的外源目的基因就算全部制备妥当。

基因导入猪基因导入的操作程序如图18:

首先选择好繁殖能力正常的母猪。为了从一头母猪中获取更多的受精卵，要用孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对供体母猪做超数排卵处理。经过这种处理的母猪排卵数增加1～2倍。供体母猪发情后配种。最后一次配种后的24小时，以手术方法从母猪的输卵管内冲取受精卵。猪的受精卵直径只有150微米左右，肉眼看不见，必须借助于解剖显微镜才能将受精卵从冲卵液中吸取出来。由于猪受精卵的细胞核被浓厚的细胞质遮盖，即使在高倍的显微镜下，也不能直接看见细胞核。所以要将受精卵通过高速离心机，以1.5万转/分的速度离心3～5分钟。离心后的受精卵置于显微操作仪的倒置显微镜下，就可以进行基因注射了。

图18　猪基因导入操作程序

用于基因注射的注射针和固定受精卵的吸管要事先制备好。注射针用特制的毛细玻璃管，通过专用的拉针仪进行拉制，其针尖的外径不能超过10微米。固定受精卵的毛细吸管大小要适宜，一般外径可在100～150微米左右，内径可在10～20微米左右，其端部要用专用的融锻仪烤制的非常平滑，以避免受精卵的损伤。

注射时，将吸有基因溶液的注射针插入受精卵的细胞核，按每核注入2微升，约含500个左右基因拷贝的剂量，将基因注入核内，以看到核膨胀、而核不破裂为度。

注射基因的受精卵就可以移植了。移植的方式有两种:自体移植和异体移值。所谓自体移值，就是将受精卵移回其自身母猪的输卵管内。异体移植，则是将受精卵移入另外一头母猪的输卵管内。在异体移植的情况下，受体母猪要做同步发情处理。即与供体母猪同时用PMSG和HCG处理，使供、受体母猪同时发情。也可以在大群内选择与供体自然同步发情的母猪做受体。由于猪是多胎动物，而且经显微注射的受精卵成活率下降，所以不管是自体移植还是异体移植，每头受体母猪以移入20枚左右的受精卵为宜。湖北省农科院魏庆信等人的试验表明，自体移植与异体移植相比，受胎率提高30%，产仔率提高2倍。

移植后的母猪，要精心地饲养管理，多补充些青饲料，防止流产和胎儿的早期死亡。

转基因猪的检测受体母猪分娩后，从仔猪的耳朵或者尾尖剪取一小块组织，提取组织细胞中的总DNA，然后进行整合检测。整合检测的方法主要有3种:斑点杂交、印迹杂交和PCR法。前两种分子杂交的方法，首先要制备好杂交探针。探针是导入的外源基因中相对于猪基因组的特异DNA片段。例如:以绵羊启动子与猪生长激素基因的融合基因做为外源目的基因，绵羊启动子就是相对于猪基因组的特异DNA片段，就可以用来做转基因猪整合检测的探针。制备好的探针要用同位素或者生物素标记。标记好的探针就可以与每头仔猪的总DNA进行杂交了。如果某头仔猪整合了外源基因，那么杂交的结果就是阳性，否则是阴性。用PCR法做整合检测，首先要根据外源基因中特异片段的DNA序列。设计一对引物。然后分别以每头仔猪的总DNA为底物，在PCR仪内进行扩增。扩增后的产物做核酸电泳，出现了特异片段的电泳带，就表明检测的这头猪整合了外源基因，是转基因猪，否则，属非转基因猪。

由于外源基因整合的位点、数量的不同以及其他方面的原因，并不是所有的转基因猪都能表达目的基因，而且不同个体表达的水平也不一样。所以对转基因猪还要进行表达检测。表达检测一般采用蛋白质杂交的方法，也可以用其它方法测定目的基因表达的产物，做定性和定量的分析。例如导入外源生长激素基因的转基因猪，就可以用放射免疫的方法或其它方法，检测血清中生长激素的浓度，来判断是否表达以及表达的水平。

通过上述的检测，筛选出高效表达的个体，构建转基因猪的工作就全部完成了。通过转基因猪的繁殖传代，就可以获得大量的转基因猪。

基因转移方法，正在不断研究中，转移的方法还有重组逆转病毒感染和多能胚胎于细胞的转化，最后转移至胚泡中等等。

(2)转基因猪的应用前景

转基因猪的出现虽然只有十几年的历史，但是已经显示了广阔的应用范围和诱人的前景。综合国内外的研究，可以根据目的基因的不同类型，将转基因猪的应用概括为3个方面。

应用于猪的育种，改良品质，提高生产性能和抗病力如本文前面所述，导入生长激素基因，以及促生长激素释放因子，类胰岛素生长因子等。目的在于培育出生长快、耗料少、瘦肉率高的新品系(种)。

导入抗病基因，可以培育出抗某种病或具有广谱抗病性的品系。国外有人将干扰素基因导入猪的基因组，所获得的转基因猪对病毒的抗性有所提高。湖北省农科院1994年将抗猪瘟病毒的基因导入湖北白猪的基因组，1995年得到了对猪瘟病毒表现出一定抗性的转基因猪。猪瘟是对养猪业危害最大的烈性传染病，全世界每年都有数以百万头计的猪死于猪瘟，造成重大的经济损失。今后的继续努力研究，培育出抗猪瘟的品系，其意义是不言而喻的。

转基因猪做生物反应器，生产特殊的医用蛋白质这方面的研究近几年发展很快。1991年美国DNX公司的科学家将人的血红蛋白基因转移到猪的基因组，得到3头携有人血红蛋白基因的转基因猪，其血液中含15%的人血红蛋白，经分离提纯，即可做为人血液的代用品。目前他们正在完善这项研究，提高产品的生物活性，同时扩群繁殖，建立专供人血液的养猪场。弗吉尼亚州立大学的科学家，将特异乳腺表达的载体与人的抗凝固蛋白C基因相连，得到28头可以生产这种蛋白质的转基因猪。目前，他们研制了猪的挤奶器，给每头母猪挤奶，然后从猪奶中分离C蛋白，再经提纯，即可直接用于人的临床，预防并治疗心脏病发作，由毒物造成的休克以及致死性的血液凝固等症。湖北省农科院正在构建可以生产人血清白蛋白的转基因猪。人血清白蛋白广泛应用于治疗失血、创伤引起的休克、低蛋白血症等。目前由于生产的原料——人血液的来源有限，所以产品仅能满足市场需求的2%。这项研究成功，不仅可以从转基因猪血液中大量生产人血清白蛋白，满足市场的需求，而且还可克服人血来源的制品中，潜在的某些病原(如爱滋病毒、乙肝病毒等)感染的威胁。

转基因猪做人体器官移植的供体器官移植是挽救成千上万器官或组织受到严重损伤病人生命的主要手段。目前，临床上对器官移植的需求十分巨大。由于捐献器官的严重不足，致使无数患者在焦急等待中死亡。

猪组织器官的形态和解剖结构及大小与人类最为相近，而且猪繁殖能力强，饲养管理容易，如果技术上成熟，将是最理想的器官供体。妨碍异种器官移植的主要因素是排斥反应。为了克服这方面的因素。1992年英国剑桥大学的科学家White把可以克服异种排斥的基因——人DAF基因转移给猪，得到了转人DAF基因猪。他将这种猪的心脏移植给与人类进化上非常相近的动物——狒狒，这只狒狒存活了三个多月。这一试验结果揭示了用转基因猪的器官给人移植的可行性。因此，各国科学家纷纷投入了这方面的研究。1995年，美国食品与卫生组织批准了一项用转基因猪的心脏作为临危的心衰竭患者体外生命支持系统的试验，取得了较好的效果。我国“八六三”计划1996年批准了由中国科学院，湖北省农科院和同济医科大学共同申请的将转基因猪做人体器官供体的研究课题。

转基因猪的前景，听起来似乎是“天方夜谭”，但科学正在把神话变成现实。转基因技术对于改造传统的养猪业将越来越显示出重大的意义。正如科学家们预言的，将来人们养猪，不仅仅在于获得肉食，而且还在于获得药物、血浆、各种组织和器官。