核酸电泳技术

第四节　核酸电泳技术

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析技术等所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。

凝胶电泳操作简便、快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心）所无法分离的核本片段，是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。

一、琼脂糖凝胶电泳

（一）原理

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。将凝胶置电场中，在中性pH下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

（二）仪器及试剂

仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。

试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。

电泳缓冲液常用TBE（1000ml中含5.4gTris，2.75g硼酸，2ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）

溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，它可以嵌入核酸链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移，将凝胶置紫外光下，插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于EB是一种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。

（三）凝胶的制备和电泳操作方法

1.用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的胶板的边缘圈封，制成胶模，置水平工作台上。

2.称取适量琼脂糖，置电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解。

3.待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB贮存液使终浓度达0.5mg/ml。

4.在距离胶模底板0.5～1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度为3～5mm，注意避免产生气泡。

5.凝胶完全凝固后，移去梳子和透明胶，将凝胶放入电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好过胶面约1mm。

6.将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中。

7.接通电源，使样品槽在负极端，用1～5V/cm的电压，电泳适当时间。

8.电泳结束后，可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察，并拍照记录，也可将不含EB的凝胶在0.5μg/ml的EB溶液中染色30～45min，再如上观察和拍照，记录结果。

（四）凝胶摄影

需配置135照相机，全色135胶卷，照相机固定架，近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。操作需在暗室进行，将相机固定好，把凝胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。

（五）注意事项

EB溶液的净化处理　由于EB具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。

1.对于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下处理。

（1）将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5μg/ml。

（2）加入一倍体积的0.5mol/L KMnO₄，混匀，再加入等量的25mol／L HCl，混匀，置室温数小时。

（3）加入一倍体积的25mol/L NaOH，混匀并废弃。

2.EB含量小于0.5g/ml的溶液可如下处理。

（1）按lmg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1h。

（2）用滤纸过滤并将活性炭与滤纸密封后丢弃。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）

（一）原理

聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N，N，N＇，N＇－四甲基乙二（TEMED）和过硫酸铵以及交联剂N，N＇－亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。根据所要分离的核酸片段大小，可制备不同浓度的凝胶。

（二）凝胶的制备和电泳

由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下，仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触，从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。

1.材料与方法

（1）试剂配制

①30%丙烯酰胺：100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’－亚甲双丙烯酰胺。

②5×TBE：每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。

③10%过硫酸铵:10ml双蒸水中含1g过硫酸铵。

（二）凝胶的制备和电泳操作

①将玻璃和垫条事先用去污剂刷洗，并经自来水和无离子水冲洗干净，晾干。装置时，将较大的玻璃板平放在工作台上，将两个垫条放在玻璃板两侧，涂上少量凡士林，并将上层玻璃板置于垫条上，用夹子将玻板连同垫条夹紧，底部用1%琼脂糖密封。为防止漏胶，除放梳子一边外，其余三边用防水胶带密封。

②根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量，计算配制溶液（100m1）。将35μl TEMED加入100ml混合液中，混匀，然后均匀连续注入两玻璃板空隙中。

③立即插入电泳梳，勿使梳齿下形成气泡。

④室温聚合1h，梳齿下出现折光带时，表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用，可用纱布或滤纸（用1×TBE浸泡）包盖于凝胶顶部，置4℃保存1～2d。

⑤拔掉梳子，立即用水冲洗加样孔。

⑥除去底部胶带，将凝胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液，驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔。

⑦将核酸样品与适量6×凝胶加样缓冲液混合，并加入凝胶加样孔中。

⑧接通电源，正极与下槽连接。电压一般控制在1.8V/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲，甚至引起小DNA片段的解链。

⑨电泳毕，取下玻板和凝胶，放在工作台上，从夹层一角轻撬，将上面的玻板轻轻移开，并小心揭下凝胶，置染色液中染色并进行结果观察。

（3）凝胶的染色和观察：聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色，常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。银染法的灵敏度较高，可如下操作。

①将凝胶置固定液（10%乙醇、0.5%冰醋酸）中固定10min。

②双蒸水洗1～2次；

③置0.01mol/L AgNO₃溶液中，室温反应15min～30min。

④充分水洗。

⑤置NaOH－甲醛混合液（200ml 3% NaOH，含1ml甲醛）中反应至条带显色清晰，本底适宜。

⑥用5%冰醋酸终止反应。