毛细管电泳和其他分离技术

毛细管电泳 （Capillary Electrophoresis，CE）是待测物质在充满缓冲溶液的毛细管中，在高压电场的作用下，按淌度或分配系数的差别而实现高效、快速分离分析的新型电泳技术。早在1937年，瑞典科学家Tiselius首次采用电泳分离技术从人的血清中分离出白蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白和γ－球蛋白，并因此获得1948年诺贝尔化学奖。1981年，Jorgenson和Lukacs使用内径为75μm的熔融石英毛细管，在30k V电压下进行区带电泳分离蛋白质，理论塔板数超过每米40万，获得了从未有过的柱效，充分展现了窄孔径毛细管电泳的巨大分离潜力。与传统的电泳技术和现代色谱技术相比，毛细管电泳具有高效、快速、进样量少、试样对象广、操作成本低等特点。

13．5．1 电泳基本原理

1．粒子的电泳迁移

（1）电泳淌度

在外电场的作用下，离子移动的速率v为：

vi＝μiE

式中，μi为离子的电泳淌度（electrophoretic mobility），又称为电泳迁移率，通常单位为cm2·V－1·s－1，E为毛细管柱进样端至检测窗口间的电场强度，单位通常为V／cm。

从上式可以看出，离子的电泳淌度不同，在电场中移动的速率就不一样，因而穿过相同的距离到达检测器所需的时间就不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳淌度与分析物质所带电荷量呈正比，与溶剂的摩擦阻力系数呈反比。离子的大小和形状、移动时介质的黏度决定了分析离子的摩擦力。对于大小相同的离子来说，所带电荷量越大，所获得的驱动力就越大，因而移动的速率也就越快。对于具有同样电荷的离子，离子越小，摩擦力越小，移动的速率就越快。当两种力度作用达到平衡时，离子做匀速运动，电泳进入稳态。

根据电学定律可知，电场作用力FE是离子电荷q和电场强度E的乘积：

FE＝q E

而根据流体力学，球形离子的流动阻力Ff与离子的有效半径r、运动速率v和溶剂的黏度η成正比：

Ff＝6πηrv＝6πηrμE

所以：

因此可用离子的电荷－尺寸比代表这两种效应。

（2）电渗流

目前绝大多数毛细管是石英材料，在其内充入p H≥3的电介质时，管壁表面硅羟基解离而带负电荷，与之接触的缓冲液形成双电层，水相与石英毛细管相接触的表面带一层正电荷，产生电位差 （称Zeta电位）。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子层使溶液在毛细管内整体向负极方向移动，这就是电渗现象。这种电渗力驱动下的毛细管中，整体液体的流动称为电渗流 （electroosmotic flow）。

电渗流大小可以用电渗淌度（μEOF）来衡量。μEOF取决于电泳介质及双电层的Zeta电位：

式中，ε为介电常数，ξ为Zeta电位。

由于毛细管电泳是电驱动系统，在毛细管中流体的流型呈扁平形的塞子向前流动，故称之为塞式流，如图13－22（a）所示。而在压力驱动系统中 （如HPLC），流型呈抛物线形向前流动，如图13－22（b）所示。试样区带随着流型不同而发生区带宽度的变化是导致毛细管电泳高效分离的重要原因。

图13－22 流型和相应的样品区带

（a）电渗流 （b）高效液相色谱

当毛细管内溶液的p H＜2时，毛细管内表面的硅羟基解离受到抑制，此时电渗流淌度很小，通常可忽略不计。

（3）表观淌度和出峰顺序

在存在电渗的情况下，离子在电场中的实际迁移速率是它本身的迁移速率和电渗速率的代数和：

v＝（μEOF＋μi）E

对于表面没有修饰的石英毛细管，电渗流由阳极移向阴极。带正电荷的粒子所受电场力与电渗流方向一致，其迁移速率为v EOF＋vi，先流出毛细管；中性粒子不受电场作用，其迁移速率等于v EOF，随电渗流一起流出；带负电荷的粒子所受电场力与电渗流方向相反，若其本身的电泳淌度小于电渗流淌度，则其也向检测器移动，其迁移速率等于v EOF－vi，后流出。各种粒子因迁移速率不同而实现分离 （见图13－23）。

图13－23 不同离子在毛细管电泳中分离

2．影响峰宽的因素

色谱中的塔板和速率理论仍然可以用来描述毛细管电泳中的分离过程。若以电泳峰的标准偏差或方差 （σ）表示理论塔板数n，则：

式中，l为溶质的迁移距离，即毛细管的有效长度，σT是各种引起区带展宽因素的总和，为：

式中，σ2dif为扩散因素，σ2inj为进样因素，σ2ads为吸附因素，σ2det为检测器因素，σ2temp为温度因素，σ2ed为电分散因素。

扩散是造成毛细管电泳分离区带展宽的重要原因。但由于电渗流驱动的平面流型，径向扩散引起的峰展宽比色谱法中小得多。纵向扩散决定分离的理论极限效率。如果进样体积大于扩散控制的区带宽度，则分离就会变差。毛细管电泳中进样量太小，对检测器的要求就高，因此操作过程中需平衡两者的关系。

毛细管比表面积大，增加了吸附作用，特别是分离碱性蛋白质和多肽时，因为这些物质具有较多的电荷和疏水性基团，吸附作用可能引起电泳峰拖尾，甚至会引起不可逆吸附。一般采用涂层的方法减轻组分在管壁的吸附，如聚乙二醇或聚丙烯酰胺等，也可以在缓冲溶液中加入大量的两性电解质，增大离子强度，减小吸附。

电流通过电解质而产生的热量称为焦耳热 （joule heat）。焦耳热可导致毛细管内部的温度梯度不均匀和局部黏度的变化，从而引起区带展宽。由于毛细管的内径细，比表面积大，有效地限制了热效应。因而可以在毛细管电泳中采用较高的电场强度，提高分辨率。但使用较高离子强度的缓冲溶液时，需要考虑焦耳热的影响。

电分散是由于试样的离子强度与缓冲溶液的离子强度不匹配引起的，它使试样峰变形，从而影响分离效率。在毛细管电泳中，一般试样溶液的离子强度远远小于缓冲溶液的离子强度，如果不考虑富集因素，可以提高试样溶液的离子强度。

3．毛细管电泳的分离效率

理想情况下，纵向扩散被认为是毛细管电泳过程中造成区带变宽的唯一因素。色谱理论的纵向扩散项以下式表示：

式中，D为组分的扩散系数，t为组分在毛细管中的迁移时间，L为毛细管的总长度，l为毛细管的有效长度，U为加在毛细管两端的电压。将上式代入n＝可以得到毛细管电泳的理论塔板数表达式：

式中E为电场强度。上式表明采用高电场强度对分离是有利的。

13．5．2 毛细管电泳的分离模式

1．毛细管区带电泳

毛细管区带电泳 （Capillary Zone Electrophoresis，CZE）是在毛细管内充满缓冲溶液，溶质以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离，其分离的基础是溶质的淌度差别。由于毛细管电泳的液体驱动力为塞式电渗流，溶质区带在毛细管内几乎不发生扩散，因此CZE具有高柱效。在CZE中，通过改变缓冲溶液的组成、p H、电场强度及加入有机添加剂等操作参数可以控制电渗流，实现高效分离。CZE可以同时分离阳离子、阴离子和中性溶质。CZE操作简单，是目前最常用的一种操作模式，广泛用于氨基酸、多肽、无机或有机离子和对映体的分离分析。

2．胶束电动色谱

胶束电动色谱 （Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC）是电泳技术与色谱技术相结合的分离模式。它既能分离中性溶质又能分离带电组分。

在胶束电动色谱的电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，使其浓度超过临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration，CMC），例如十二烷基磺酸钠的CMC为8～9mmol／L，表面活性剂分子由于其疏水基团的作用而聚集在一起，形成三维团状结构的胶束。由于胶束的存在，使MEKC中有两相：一相是导电的缓冲溶液水溶液相；另一相是带电的离子胶束相，它是不固定在柱内的载体 （可称为拟似固定相）。对于中性溶质，由于疏水性不同，与水相和胶束相分配系数不同而得到分离。

3．毛细管凝胶电泳

毛细管凝胶电泳 （Capillary Gel Electrophoresis，CGE）是将生物大分子如蛋白质、DNA片段，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。毛细管凝胶电泳一般是在多孔的凝胶基质上进行，如聚酰胺聚合物。在凝胶的孔穴中含有缓冲混合物，分离在穴中进行。不同大小分子受到的阻力不同，大分子受到阻力比小分子大，电泳迁移速率慢；反之，小分子受阻力小，迁移快，结果使溶质按其分子大小得到分离。在毛细管凝胶电泳中，常用的凝胶有共价交联的聚丙烯酰胺、氢键结合的琼脂糖及线性交联的聚合物。

4．毛细管等电聚焦

毛细管等电聚焦 （Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）是基于不同蛋白质或多肽之间等电点 （p I）的差异进行分离的。当溶液的p H正好是两性物质的等电点时，两性物质所带的净电荷为零，它们在电场中不移动。高于此p H时，它们失去质子而带负电荷，在电场作用下向正极移动；低于此p H时，它们移向负极。若在毛细管柱中缓冲溶液内形成一个p H梯度，从一端向另一端递增，当两性物质进入毛细管柱中p H高于它的p I的地方，它就带负电荷，趋向正极，顺着这个方向迁移，柱中p H逐渐变小，最后到达p H等于它的p I的部位，此时净电荷为零，迁移速率也为零。通过等电点聚焦，将试样中不同物质浓缩在不同的等电点处，从而达到分离的目的。

13．5．3 高效毛细管电泳装置

高效毛细管电泳仪主要由高压电源、毛细管、缓冲溶液瓶、检测器、数据处理系统构成，如图13－24所示。

图13－24 毛细管电泳装置示意图

高压电源是分离的动力，直流输出电压一般为0～30k V，输出电流为0～1m A。大部分电源有极性转换功能。商品高压电源有恒压和恒流操作模式。毛细管是分离通道，普遍采用外涂聚酰亚胺涂料的熔融石英毛细管，内径为25～100μm，长度为20～100cm。毛细管尺寸的选择主要考虑分离效率和检测灵敏度，内径越小，分离效率越高，但由于小内径的毛细管限制了进样量，对检测器的灵敏度要求也高；毛细管越长，分离效率越高，但因为高压电源输出电压的限制，长毛细管将导致低的电场强度，从而影响分析时间。

缓冲溶液瓶一般用玻璃或聚丙烯制成，体积为1～5m L。简易的毛细管电泳装置也可使用离心管盛缓冲溶液。

检测器是毛细管电泳仪的关键部分，因为毛细管内径很小，进样量是纳米级，因此需要检测器有高灵敏度、高选择性和快速响应的特性。目前能和毛细管电泳配套的有紫外－可见光、荧光、激光诱导荧光、电化学、质谱等检测器。

紫外－可见光检测器是毛细管电泳中应用最广的检测器，可分为固定波长、可变波长和多波长扫描二极管阵列 （DAD）检测器。前两类结构简单、灵敏度较高，适用于常规分析，后一类能提供时间－吸光度－光谱的三维谱图，用于定性分析和纯度鉴定及毛细管电泳条件的选择。激光诱导荧光检测器 （Laser－Induced Fluorescence Detector，LIFD）是毛细管电泳最灵敏的检测器。电化学检测器中，电导检测器是通用型检测器，安培检测器是高灵敏的选择型检测器，用于离子型化合物分析。表13－14列出了与毛细管电泳联用的一些检测器的性能指标。

表13－14 各种检测器及其特点

数据采集和处理是现代毛细管电泳实验不可缺少的一部分。一般用数据采集卡将模拟信号传入计算机后，用毛细管电泳工作站 （或色谱工作站）对谱图进行处理，得出电泳过程中的一系列相关数据。专业的毛细管电泳系统进一步强化了自动控制的功能，其进样、冲洗、电压和电流控制及控温都由程序完成。

13．5．4 高效毛细管电泳的应用

1．无机离子的分离检测

与离子色谱相比，毛细管电泳在小离子分离分析上具有许多优势，它能在数分钟内分离出多种组分 （图13－25），而且不需要任何复杂的操作程序。虽然绝大多数无机离子不能直接利用紫外吸收检测，但可以进行间接紫外吸收检测，即在具有紫外吸收离子的介质中进行电泳，可以测得无吸收同符号离子的倒峰。阳离子可以选择芳胺、咪唑、吡啶及其衍生物等；阴离子可以选用苯甲酸根、铬酸根等作为背景电解质对离子。

图13－25 无机阴离子的快速分离

1．Cl－2．Br－3．SO42－4．NO3－5．NO2－6．PO43－

注：每种离子浓度为1mg／L；缓冲溶液中对离子为铬酸根。

2．核酸片段的分析

DNA是由1′－碱基－2′－脱氧核糖通过和3′－和5′－位羟基磷酰化连接而成。组成DNA的碱基有四种：腺嘌呤 （A）、鸟嘌呤 （G）、胞嘧啶 （C）和胸腺嘧啶 （T）。DNA可被酶降解成片段，也容易由于物理或化学作用而造成基因突变。DNA在254nm处产生最大吸收。DNA片段的分离多用CGE分离技术，长链凝胶分子适于分离长链DNA片段，短链凝胶分子适于分离短链DNA片段。如琼脂糖适于分离碱基小于1000的DNA。凝胶筛分效应使核酸片段分离具有很高的分辨能力，甚至可以达到单碱基分辨。图13－26为CGE分离双链DNA限制片段谱图。

图13－26 CGE分离双链DNA限制片段谱图

DNA片段 （bp）：1．72 2．118 3．194 4．234 5．271＋281 6．310

7．603 8．872 9．1078 10．1353

3．抗生素的分离检测

喹诺酮类抗生素是人工合成的萘啶酸衍生物，通过抑制DNA旋转酶的活性杀死细菌。因其有抗菌谱广、吸收好、血液浓度高、能迅速分解到各组织、半衰期长、能制成各种剂型等特点而得到迅速推广。但喹诺酮抗生素对人体有一定的副作用，主要表现为胃肠道反应、皮肤损害、中枢神经系统反应、泌尿生殖系统反应及肝功能损伤等。欧盟早在20世纪90年代就对肉类中喹诺酮类抗生素的最大残留量进行了限制。图13－27是五种喹诺酮的毛细管电泳分离检测图。

图13－27 五种喹诺酮类抗生素标准品的毛细管电泳图

1．洛美沙星 2．环丙沙星 3．氧氟沙星 4．氟罗沙星 5．帕珠沙星

注：样品浓度为10mg／L。

13．5．5 微流控芯片技术

微流控芯片 （microfluidic chip）技术又称微流控芯片实验室 （microfluidic lab on a chip），是以微通道形成网络，将试样制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，以可控流体贯穿整个系统，取代了常规化学分析实验室的各种功能的一种平台。毛细管电泳技术的发展为微流控芯片技术研究的突破提供了基本条件。与毛细管电泳相比，微流控芯片技术试样和试剂消耗进一步下降，分析装备更加集成化、自动化。

1．材料和结构

常用制作芯片的材料有硅、石英、玻璃及有机高分子聚合物等。硅具有良好的化学惰性和热稳定性，单晶硅生产工艺和微加工技术已经趋于成熟，可在硅片上使用光刻或蚀刻方法复制出高精度的图形结构。硅材料的不足之处是易碎、价格偏高、不透光、电绝缘性较差，因此在微流控芯片中的应用受到限制。通常采用氧化的方法使单晶硅表面产生一层二氧化硅而达到绝缘效果。

石英和玻璃弥补了单晶硅在电学和光学方面的不足，其价格便宜，并且采用与硅片类似的光刻和蚀刻技术也可以将微结构刻在石英和玻璃上，因此，它们很快成为微流控系统的主要材料。

可用于微流控芯片制作的高分子聚合物主要有硬质聚合物、弹性聚合物和溶剂挥发型聚合物。较常用的弹性聚合物有聚碳酸酯 （PC）、聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA）等；弹性聚合物有聚二甲基硅氧烷 （PDMS），俗称硅橡胶；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸和氟塑料等。

微流控芯片的通道虽然有很多种，最基础的是十字交叉结构 （图13－28）。此类芯片的设计简单，操作方便。将试样置于连接进样通道的任一进样槽中，在通道两端加上合适的电压，离子试样就会在电场的作用下经过分离通道。分离时，只需在垂直于进样通道的方向上施加分离电压，试样就向检测窗口方向迁移并发生分离，再由检测器检测。微流控芯片分析的一个优势就是芯片的通道可形成多个平行的分析单元或通道阵列，从而提高分析速度。

图13－28 微流控芯片结构示意图

1．缓冲溶液 2．试样溶液 3．分离通道 4．进样通道 5．检测器

2．检测技术

基于不同原理的众多检测方法在微流控芯片分析系统中都得到了研究应用。检测器大致可分为光学检测器、电化学检测器、质谱检测器等。

常用的光学检测器有激光诱导荧光检测器 （LIF）、化学发光检测器和紫外检测器等。LIF是目前最灵敏的检测方法之一，通过光子计数等技术可以达到单分子检测。由于核酸、蛋白质及有些氨基酸自身带有荧光，或者通过衍生的方法而产生荧光，因此在微流控芯片电泳研究中，LIF是一种应用最为广泛的检测器。紫外检测器是一种通用的光学检测器，它基于有紫外吸收的物质通过光路时引起透射光强度的降低而对物质进行检测，定量关系符合朗伯－比尔定律。但由于微流控芯片通道深度一般为数十微米甚至更少，产生紫外吸收的光程受到限制，因而此方法的灵敏度受到限制；另外一个局限性是要求芯片材料不吸收紫外波段的电磁波。以上原因导致紫外检测法不如在高效液相色谱或毛细管电泳中的应用普遍。化学发光检测法是高灵敏度的检测方法之一，其检测灵敏度甚至可以和LIF媲美。化学发光检测法不需要光源，仪器结构比较简单，造价相对便宜，容易实现集成化，因而在微流控芯片分析中的应用也较广泛。但化学发光检测的不足之处是高效的化学发光体系种类比较少，高压电场下化学发光试剂对试样的分离可能产生影响等。

电化学检测器中常见的有安培检测器和电导检测器。在芯片上制作电极比较容易，而电化学检测方法的浓度检测灵敏度不随检测体积的减小而降低，这是其相比于光度吸收检测法 （如紫外检测）的一个显著的优点。安培检测器是基于具有电化学活性的物质在某个恒定的电位下在工作电极上发生氧化还原反应而产生电流的检测方法，结合使用氧化还原电位可以对待测物质进行定性、定量分析。安培检测法的灵敏度高，接近LIF，具有一定的选择性。电导检测器对溶液电导率的改变进行检测，是一种通用的检测器，尤其适合于无机离子、氨基酸等小分子的检测，常用于微流控芯片研究的是非接触电导式检测器。

质谱技术能提供组分分子的结构和定量的信息，现已成为蛋白质和多肽研究工作中不可或缺的工具。质谱检测的高灵敏度和高效率正迎合了微流控芯片技术的小试样量及微流控系统的特点，两者联用可满足基因组学与蛋白质组学等生物分析的需要。由于质谱检测器要求检测对象进入其离子化源中离子化，再进行后续的分析检测，因而芯片和质谱仪之间需要相应的接口装置。

3．应用与进展

微流控芯片的最大特点是把高速分离和试样处理有机结合，目前已经用于各种离子和非离子组分的分离检测，例如用于氨基酸、细胞及其代谢产物、核苷酸、DNA等的测定。目前微流控芯片应用于蛋白质和核酸的高通量分离的研究十分活跃。

DNA测序包含一系列复杂的制样过程，如细胞的提取与培养、细胞的溶解和核酸的提取、目标DNA的扩增、扩增产物的脱盐和浓缩处理、进样和分离、检测和数据处理等。按照常规方法需要试样的量比较大，其试样处理、试剂消耗等非常大。利用微流控芯片技术直接在芯片上设计各种联通的试样处理节点，并和分离通道有机结合，不仅可以最大限度地减少试样的用量、转移次数和转移距离，还可以实现快速的试样处理和分析，降低操作费用。蛋白质的分析要求快速的分离方法，微流控芯片的分离通道一般小于10cm，满足实现蛋白质快速分离的基本条件。在芯片上采用等电聚焦技术，更有利于在短分离通道内实现高速的聚焦分离，并有利于采用多种手段进行检测，如全柱照相法、移动LIF检测、移动非接触电导法检测等。

随着微流控芯片技术的发展，其应用潜力已经逐渐受到分析工作者的重视，因此其应用范围也越来越广，如原位反应、在线萃取、连续制备、细胞分析、药物筛选等。