啤酒双乙酰测定中应注意的问题

啤酒双乙酰测定中应注意的问题

聂聪^1，2　任昆²

（1.天津科技大学生物工程学院　天津　300222；

2.山东轻工业学院食品与生物工程学院　济南　250100）

摘要：啤酒的风味问题已经受到消费者的极大关注，也是啤酒企业进行质量控制的重要内容。双乙酰是啤酒中一种重要的风味物质和国标检测项目，其口味阈值为0.15mg/L，优质啤酒的双乙酰含量大多控制在0.05mg/L以下，双乙酰含量已成为啤酒发酵成熟与否的重要标志。本文对影响双乙酰测定的因素进行探讨，确定了影响测定结果的主要因素为蒸馏速度、收集温度、暗处反应时间、消泡剂、比色时间和酒样加入时间。

关键词：双乙酰紫外分光光度法

啤酒最令消费者关注的是其风味问题。啤酒的风味物质主要由挥发性酯类、醇类、酮类、醛类、酸类以及含硫化合物组成。啤酒中已知的风味物质有800多种，它们赋予啤酒特殊的风味，而且又通过一系列复杂的物理及化学过程影响着啤酒的风味，其中影响口味最主要的物质是双乙酰。双乙酰作为这些风味物质中最重要的一种，是品评啤酒成熟与否的主要依据，其含量多少直接影响啤酒的品质。双乙酰在啤酒中含量超过其风味阈值，会给啤酒带来不愉快的馊饭味，其风味阈值也比较低，对淡爽型的淡色贮藏啤酒来说，双乙酰含量以控制在0.1mg/L以下为宜，优质啤酒最好控制在0.05mg/L以下。双乙酰检测的准确度会影响生产过程中双乙酰的还原时间和发酵周期，进而影响生产成本。

1　材料与方法

1.1　双乙酰测定^[1]

采用紫外分光光度法测定啤酒中双乙酰的含量，以mg/L报告其结果，测定值保留两位小数。

1.2　试剂

盐酸溶液：移取33.3ml盐酸约为1.18g/ml以水稀释至100ml混匀。

邻苯二胺溶液：称取0.100g邻苯二胺溶于上述盐酸溶液中，定容至10ml，混匀，放于暗处当天使用。

1.3　测定方法

1.3.1　蒸馏

将双乙酰蒸馏器装好，加热蒸汽发生瓶使水至沸腾，蒸汽预热后置25ml容量瓶于冷凝器下口，外加冰浴冷却。加1～2滴有机硅消泡剂或甘油聚醚于100ml量筒中，再注入100ml未经除气的预先冷至5℃左右的酒样，迅速加入已预热的蒸馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水封口进行蒸馏直至蒸馏液接近25ml时，蒸馏需在3min内完成取下容量瓶恢复至室温后用水定容至刻度混匀。

1.3.2　显色与测定

分别吸取10.00ml蒸馏液于两支比色管中，于第一支管中加入0.50ml邻苯二胺溶液10g/L，第二支管中不加（空白）充分摇匀后，同时置于暗处放置20～30min。然后，于第一支管中加2.00ml盐酸溶液（4mol/L） ，于第二支管中加入2.50ml盐酸溶液（4mol/L）混匀后，在紫外分光光度计上于波长335nm下用10mm石英吸收皿以空白为参比测定其吸光度，比色测定操作须在20min内完成。

1.3.3　结果计算

按下式计算双乙酰的含量

X=A₃₃₅×2.4

式中X：双乙酰含量（mg/L） ；

A₃₃₅： 335nm波长下用10mm石英比色皿测定的吸收光度；

2.4：吸光度与双乙酰含量的换算系数。

2　结果与讨论

2.1　蒸馏速度对双乙酰测定的影响^[2]

蒸馏啤酒中双乙酰时，用调节电炉电压来控制蒸馏速度的快慢，蒸馏时间为105 （s）时，电炉电压控制在250 （v） 。蒸馏时间为140 （s）时，电炉电压控制在240 （v） 。蒸馏时间为175 （s）时，电炉电压控制在230 （v） 。蒸馏时间为355 （s）时，电炉电压控制在175 （v） 。蒸馏时间为430 （s）时，电炉电压控制在165 （v） 。蒸馏时间为458 （s）时，电炉电压控制在160 （v） 。

取下容量瓶恢复至室温后，用蒸馏水定容至刻度混匀，分别吸取10.00ml蒸馏液于两支比色管中于第一支管中加入0.50ml邻苯二胺溶液10g/L，第二支管中不加（空白）充分摇匀后，同时置于暗处放置20min。然后，于第一支管中加2.00ml盐酸溶液（4mol/L） ，于第二支管中加入2.50ml盐酸溶液（4mol/L）混匀后，在紫外分光光度计上于波长335nm下用10mm石英吸收皿以空白为参比测定其吸光度，比色测定操作在20min内完成，测定结果见表1。

表1　双乙酰测定值随蒸馏时间变化的测定结果

由表1中数据可知，蒸馏速度在3min之内时，所测双乙酰值没有明显变化，时间超过5min所测双乙酰值明显上升，估计可能是由于不同于双乙酰的物质馏出而影响双乙酰的测定。

2.2　收集温度对双乙酰测定的影响

加热蒸汽发生瓶使水至沸腾，蒸汽预热后置25ml容量瓶于冷凝器下口，在容量瓶外套一个烧杯，将烧杯内加入自来水，其他操作同前述。使用冰浴时，在烧杯内放入冰块，并加自来水，其他操作同常规操作。测定结果见表2。

表2　双乙酰值随收集温度变化结果

由表2中数据看出，馏出液收集温度对双乙酰的测定无影响。因此为方便起见，馏出液于自来水浴中直接收集即可。

2.3　暗处反应时间对双乙酰测定的影响^[3]

操作同前述，将两支比色管置于暗处放置10min，于第一支管中加2.00ml盐酸溶液（4mol/L） ，于第二支管中加入2.50ml盐酸溶液（4mol/L）混匀后，在紫外分光光度计上于波长335nm下用10mm石英吸收皿以空白为参比测定其吸光度，比色测定操作在20min内完成。做平行实验，并在暗处分别放置20、30min，测定结果见表3。

表3　双乙酰测定值随暗处反应时间变化的测定结果

由表3中数据看出，反应时间是影响反应完全的重要因素之一，暗处反应20min即可达到双乙酰与邻苯二胺反应完全的要求。

2.4　消泡剂对双乙酰测定的影响

加热蒸汽发生瓶使水至沸腾，蒸汽预热后置25ml容量瓶于冷凝器下口，外加冰浴冷却。向100ml量筒中直接注入未经除气的酒样100ml，以下同常规操作，并做平行实验。第二次测定时，在注入未经除气的酒样100ml前加2滴消泡剂，以下同常规操作，比色测定操作在20min内完成。第三次测定时加4滴消泡剂，测定结果见表4。

表4　双乙酰值随消泡剂加量变化的结果

由以上数据可知，消泡剂的加入对双乙酰的测定影响很大，但加入消泡剂的剂量多少对测定无明显影响，这再次说明消泡剂可能在双乙酰测定中有促进前体物质转化为双乙酰的推论。

2.5　比色时间对双乙酰测定的影响

紫外分光光度计上于波长335nm下以空白为参比测定吸光度，不同比色时间下的测定结果见表5。

表5　双乙酰测定值随比色时间变化的测定结果

由以上数据可知，比色测定操作须在20min内完成。超出20min，时间越长，双乙酰值越大。

2.6　酒样加入时间对双乙酰的影响

加热蒸汽发生瓶使水至沸腾，蒸汽预热后置25ml容量瓶于冷凝器下口，外加冰浴冷却.向100ml量筒中加1滴消泡剂，再注入未经除气的酒样100ml，迅速加入已预热的蒸馏器内，以下同常规操作。第二次测双乙酰时，将酒样在蒸馏前1h倒入量筒内，其他操作同常规操作。实验结果如表6。

表6　双乙酰测定值随酒样加入时间变化的测定结果

由表6数据可知取样后，要迅速蒸馏，以免温度回升和长时间存放，造成双乙酰挥发，影响双乙酰测量准确度。

3　总结

3.1　双乙酰测定结果往往比实际偏高，这主要是由于在酵母形成双乙酰的过程中，生成一种叫双乙酰甲基甲醇的物质，这种物质能较快地被氧化成为双乙酰，也更易干扰双乙酰的测定，在啤酒发酵中似乎未检出这种物质，它是造成双乙酰测定偏差的主要原因。

3.2　测定方法对双乙酰测定准确度也有一定的影响。用气相色谱法检验啤酒中双乙酰是比较准确的，用紫外分光光度计也比较可靠，但是，至今分析方法仍未达到理想程度，因为α-乙酰乳酸极不稳定。

3.3　在取样的同时，样品内存在酵母和空气以及温度上升和时间的延长，都可能直接引起双乙酰迅速变化，所以用分光光度法测定双乙酰，半成品酒样在取样的时候要尽量多放一些酒样，把管道中酵母杂质冲下去，这样取来的酒样才能较为均匀，有代表性，双乙酰测定的数值才能准确。

3.4　取样后，要迅速蒸馏，以避免温度升高存放时间长造成双乙酰挥发，影响双乙酰测量准确度。

3.5　在倒入酒样进行蒸馏时，应在3min内蒸完，否则影响测定结果。同时，蒸馏时要保持一定的流速，不要间隔，否则空气进入蒸馏器中，使酒样接触空气中的氧，发生变化影响测定结果。

参考文献：

[1]中华人民共和国啤酒国家标准GB4927-2001

[2]高文惠，罗敏，韩菊.啤酒中双乙酰的测定方法探讨.河北科技大学学报，1991，（20） 2:54～57

[3]李艳，郭小宁，王庆堂译.改进EBC法测啤酒中双乙酰及其连二酮.食品工业科技，1991，5： 52～56