微生物酶法合成-半胱氨酸的酶促反应条件优化

微生物酶法合成L-半胱氨酸的酶促反应条件优化

周昌平¹　刘淑云¹　寇广会¹　徐庆阳¹　陈宁^1，2

（1.天津科技大学生物工程学院； 2.天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：以假单胞菌（Pseudomonas sp.） TS1138为供试菌株，研究了酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件。通过考察酶源保存方式、酶促反应时间、底物浓度、酶浓度、金属离子等因素对酶活力的影响，确定了TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的最适酶促反应条件，为酶促反应动力学的研究奠定了基础。

关键词：假单胞菌；酶促反应； L-半胱氨

L-半胱氨酸（L-cysteine）是组成蛋白质的20种氨基酸之一，也是一种重要的含硫氨基酸，广泛用于医药、化妆品、食品、饲料添加剂等行业。L-半胱氨酸所带的巯基具有许多重要的生理作用，如可以缓解药物（酚、萘、苯、氰离子）中毒，促进毛发生长等作用^[1]。目前，L-半胱氨酸的生产主要依靠人或动物的毛发经酸水解或碱水解后制取，但该方法收率低，水解过程产生大量刺激性气体，废酸处理困难^[2]。另外，由于卫生问题，从毛发提取的产品不符合医药的使用标准。近年来，随着L-半胱氨酸生产技术的发展，微生物酶法生产L-半胱氨酸逐渐取代了毛发水解制备L-半胱氨酸^[3，4]。日本已报道了用DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸（DL-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid，DL-ATC）为原料，采用微生物酶法合成L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺。我国已有生产DL-ATC的厂家，但有关微生物转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的报道罕见。因此，开展微生物酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的研究具有重要意义。

1　材料与方法

1.1　菌种

假单胞菌（Pseudomonas sp.） TS1138，由南开大学生命科学学院微生物研究室提供。

1.2　培养基

完全培养基（g/L） ：牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖5，NaCl 5，pH 7.2。

种子培养基（g/L） ：葡萄糖30，DL-ATC · 3H₂O 3，酵母粉10，蛋白胨10，尿素3，MnSO₄· 5H₂O1，FeSO₄· 7H₂O0.01，MgSO₄· 7H₂O0.5，NaCl 1.5，K₂HPO₄3，pH 7.5。

产酶培养基（g/L） ：葡萄糖30，DL-ATC · 3H₂O 3，玉米浆3，尿素3，MnSO₄· 5H₂O 1，FeSO₄· 7H₂O0.01，MgSO₄· 7H₂O0.5，NaCl 3，K₂HPO₄3，pH 7.5。

1.3　培养方法

活化培养：接一环生长良好的斜面菌苔至装有30ml完全培养基的500ml摇瓶中，190r/min，29℃振荡培养12h。

种子培养：以10%接种量将上述活化培养液接入装有30ml种子培养基的500ml摇瓶中，190r/min，29℃振荡培养14h。

产酶培养：以10%接种量将种子培养物接入装有30ml产酶培养基的500ml摇瓶中，190r/min，29℃振荡培养22h。

1.4　分析方法

1.4.1　酶活力测定

（1）细胞悬液的制备：取一定体积培养液离心10min （4000r/min，4℃） ，弃去上清液，沉淀用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤并重悬。继续离心10min，洗涤，重悬。第三次离心后，洗涤，重悬菌液。该菌悬液即为酶促反应所用细胞悬液，立即使用，或置于-20℃冰箱中冻存。

（2）酶促反应：取3ml底物溶液（DL-ATC1.5%，K₂HPO₄1.5%）于10ml离心管内，接着加入1.5ml细胞悬液，置于42℃水浴中，反应2h后取出离心管，测定L-半胱氨酸含量。

（3）酶活力定义：在上述条件下，1h内转化底物生成1μg产物L-半胱氨酸所需的酶量作为一个酶活力单位（U） 。酶活力以每毫升酶液所含的酶活力单位数表示（U/ml）^[5]。

1.4.2　L-半胱氨酸含量的测定

酸式茚三酮法测定，方法见参考文献^[6]。

2　结果与分析

2.1　酶源保存方式对酶活力的影响

不同的酶源保存方式对细胞酶活力损失的影响较大，实验考察了酶源分别在-20℃和4℃下，保存不同时间的酶活力损失情况，结果如图1所示。

图1　酶源保存方式对酶活力的影响

由图1可知，酶源在4℃下保存比在-20℃下保存酶活力损失小，但在4℃下保存时间为48h时，酶活力损失已达40%，酶活力损失较严重。

2.2　酶促反应时间对产物浓度和酶活力的影响

由于TS1138菌株含有L-半胱氨酸脱巯基酶，该酶的存在使得酶法合成的一部分L-半胱氨酸产物被分解，降低了转化率和收率。实验考察了酶促反应时间对产物浓度和酶活力的影响，结果如图2所示。

图2　酶促反应时间对产物浓度和酶活力的影响

由图2可知，随着酶促反应的进行，酶活力逐渐降低，L-半胱氨酸浓度逐渐升高，当反应时间为2.5h时，L-半胱氨酸浓度基本达到最大值，在3.5h后L-半胱氨酸浓度开始逐渐下降，反应进行5h时，L-半胱氨酸浓度仅为3h时的13%，说明TS1138菌株中L-半胱氨酸脱巯基酶具有较高的活性。

2.3　底物浓度对酶活力的影响

在酶促反应过程中，底物浓度与酶促反应速度有关。在一般的酶促反应中，随着底物浓度的增加，酶促反应逐渐达到最大反应速度。实验考察了不同底物浓度对酶活力的影响，结果如图3所示。

图3　底物浓度对酶活力的影响

由图3可知，随着底物浓度的增加，酶活力逐渐升高，当底物浓度为1.8%时，酶活力达到最大值，此后随着底物浓度的增加，酶活力有下降趋势。

2.4　酶浓度对酶活力的影响

在酶促反应体系中，酶浓度与酶活力有一定的关系。实验考察了不同酶液浓缩倍数对酶活力的影响，结果如图4所示。

图4　酶浓度对酶活力的影响

由图4可以看出，随着酶浓度的增加，酶活力逐渐增大，当酶液浓缩5倍以上时，酶活力增长缓慢。

2.5　金属离子对酶活力的影响

由于某些金属离子往往是许多酶的激活剂或抑制剂，因此本实验考察了Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺五种金属离子对酶活力的影响，各离子的终浓度均为5mmol/L，结果如图5所示。

图5　金属离子对酶活力的影响

由图5可以看出，所考察的五种金属离子对TS1138菌株中DL-ATC水解酶酶系均有不同程度的抑制，其中Cu²⁺对该酶系有很大的抑制作用。

3　结论

本研究考察了酶源保存方式、酶促反应时间、底物浓度、酶浓度、金属离子等因素对酶活力的影响。研究结果表明，TS1138菌株中L-半胱氨酸脱巯基酶具有较高的活性，而且Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺五种金属离子对DL-ATC水解酶酶系均有不同程度的抑制，其中Cu²⁺对该酶系的抑制作用很大。本实验只是对微生物酶法合成L-半胱氨酸的酶促反应条件进行了初步研究，酶促反应动力学等有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]杨金奎，何璧梅.微生物方法生产L-半胱氨酸的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2001，22 （4） ：179～182

[2] Ryu，O. H.，J. Y. Ju，and C. S. Shin. Continuous L-cysteine production using immobilized cell reactors and product extractors[J].Proc.Biochem，1997，32:201～209

[3] Sano，K.，and K.Mitsugi.Enzymatic production of L-cysteine from D，L-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid by Pseudomonas thiazolinophilum: optimal conditions for the enzyme formation and enzymatic reaction[J]. Agric. Biol. Chem，1978，42:2315～2321

[4]Sano，K.，K.Yokozeki，F.Tamura，N.Yasuda，I.Noda，and K.Mitsugi.Microbial conversion ofDL-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylicacid toL-cysteineand L-cystine:screeningofmicroorganismsand identification ofproducts[J].Appl.Environ.Microbiol，1977，34:806～810

[5]刘忠，杨文博，孙丹.酶法生产L-半胱氨酸培养基的响应面分析优化[J].南开大学学报（自然科学版） ，2004，37 （1）:83～87

[6]张承圭.生物化学仪器分析及技术[M].北京:高等教育出版社，1990