培养基母液配制操作流程

培养基是组织培养中培养物赖以生存的基地。因此，在组织培养的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。

1）培养基的组成成分

大多数培养基的成分由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等5类物质组成。

无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在离体培养中以硝态氮为主，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫常用磷酸盐和硫酸盐。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其用量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的用量则较小，一般由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在。

离体培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物作为碳源，通常为蔗糖。蔗糖除作为补充碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起着重要作用。

在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果较好的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。

有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪蛋白水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。

常用的生长调节物质大致包括以下3类：植物生长素类如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- D）；细胞分裂素如玉米素（ZT）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（KT）；赤霉素。目前，组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。

2）常用培养基的状态和配方

常用培养基按状态分类，可分为固体培养基和液体培养基。固体培养基有通气性好、污染局部的优点，但具有培养材料与培养基接触不充分、有毒物质容易积累等不利因素；液体培养基则通气不好、污染全部，但具有培养材料与培养基接触充分、有毒物质不容易积累等优点。

不同培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。组织培养时，应对各种培养基进行了解和分析，以便能从中选择适宜的培养基。培养基中的激素种类和数量，随培养阶段和材料而异。

MS培养基是目前普遍使用的培养基，它有较高的无机盐浓度，保证组织生长所需的矿质营养。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时较易获得成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。与其他培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高。

B5培养基含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。研究表明，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。

N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。在组织培养中，经常采用的还有怀特（White，1963）培养基、尼许（Nitsch，1951）培养基等。它们的基本成分大同小异。怀特培养基由于无机盐的含量较低，更适合木本植物的组织培养。

3）MS培养液的配制

为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1 000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10，1/100，1/1 000加以稀释，即成培养液。培养液中各类物质制备母液的方法如下：

大量元素母液的制备。植物所需浓度大于0.5 mmol/L的元素称为大量元素，包括C，H，O，N，P，K，Ca，Mg，S。一般将大量元素配制成10倍的母液，使用时进行稀释。制备时，按表2.1中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1 L，此即大量元素母液。

表2.1　MS培养基大量元素母液配制表

微量元素母液的制备。微量元素因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1 000倍的母液。配制时，每种化合物的量加大100倍或1 000倍，逐次溶解并混在一起（见表2.2），制成微量元素母液。

表2.2　MS培养基微量元素母液配制表

铁盐制备。铁盐需单独配制，由硫酸亚铁（FeSO4·7H2 O）5.57 g和乙二胺四乙酸二钠（Na—EDTA）7.45 g溶于1 L水中配成。每配1 L MS培养基，加铁盐5 mL。

有机物的制备。有机物质主要指氨基酸和维生素类物质，都是分别称量，分别配成所需的浓度（0.1～1.0 mg/mL），用时按培养基配方中要求的量分别加入。

植物激素制备。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.01～10 mg/L。可按用量的100倍或1 000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1～2 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量0.5 N或1 N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。

以上各种混合液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，用时称重加入。

4）培养基配制的具体操作

（1）根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂（固体培养基需要）备用。

（2）固体培养基需要将（1）中称好的琼脂加蒸馏水300～400 mL，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

（3）将（1）中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至1 000 mL，搅拌均匀，配成培养基。

（4）用1 N的氢氧化钠或盐酸，滴入（3）中的培养基里，每次只要滴几滴，滴后搅拌均匀，测其p H值，直到将培养基的p H值调到5.8～6.0。

（5）将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶（或试管、培养皿等）中，并封口。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。

培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取。