转座子和质粒

20世纪50年代，在日本的医院里发生了一次不同寻常的痢疾流行，从患者身上分离到的志贺痢疾菌（Shigella　dysenteriae）竟然能同时具备对青霉素、四环素、链霉素、氯霉素和对氨基苯磺酰胺等多种抗生素的抗药性。还发现所有的抗药基因以一个抗性基因集团的形式传递，纵向可传递给子裔细菌，横向可以传递给其他对药物敏感的志贺痢疾菌，甚至还可以传递给别的细菌种群。这种具有多重抗药性的病原菌给患者带来了极大的痛苦，给医生带来了极大的困惑。

这种现象很快引起了遗传学家的注意，他们发现这个抗性基因集团的行为与细菌中的性因子F十分相像，也是一个能独立复制的环状DNA分子，定名为R质粒。在证实R质粒存在之后，就会很自然地提出几个问题：①这些质粒的作用模式是怎样的？②质粒怎样获得新的遗传特征？③质粒怎样携带抗性基因在细菌之间转移？

如果把R质粒的环状DNA双链分子分离出来，加温变性后慢慢冷却退火，在电镜下可以看到有些复性后的质粒不呈现典型的环状而是特殊的哑铃状，只是两个球不一般大（图7-9）。图中环状部分是单链DNA，而连接两个单链环的是一个双链的“柄”，它由两个反向重复序列所形成，研究表明这是一对插入方向相反的IS1。整个R质粒似乎就是两个IS 1中间夹了一个抗性基因（图7-10），例如携带卡那霉素抗性基因的是一对IS1，携带四环素抗性基因的是一对IS3。携带质粒中的一个或几个功能基因与一对反向重复序列，构成一个能独立转移的遗传因子叫作转座子（transposon，Tn）。而质粒中除了Tn之外的部分是与抗性基因转移相关的功能基因，所以称为抗性转移功能区（RTF区，resistance transfer function region）（图7-11）。RTF区使质粒能在细菌间的交接中，从一个细菌转移到另一个细菌中去。一个Tn是一个独立的转移单位，它能从一个质粒跳跃到另一个质粒上去，也可以从质粒跳跃到细菌的基因组上去。下面我们来分析一个转座子跳跃转移的实际例子。

图7-9　质粒DNA变性后重新冷却复性后形成的哑铃状结构的电镜照片（引自S.N.Cohen）

图7-10　转座子结构示意

（a）变性前，转座子的双链DNA中有一对反向插入的IS；（b）复性后，反向插入的IS使单链环状DNA发生内部杂合，两个IS成为一对反向重复序列，彼此形成双链，转座子上的功能基因（如抗性基因）成为单链的环

图7-11　质粒和插入了转座子的质粒

假设转座子Tn3携有氨苄西林抗性基因ApR，位于大肠杆菌的质粒R64-1上。令Tn3转移到另一个质粒RSF1010上去，RSF1010也有一个转座子Tn4，携有磺胺的抗药性基因SuR（相应的敏感基因为Sus）和链霉素抗药性基因SmR（相应的敏感基因为Sns）。整个反应可用下式表示：

操作时，先把R64-1的DNA分离纯化，同时用氯化钙处理携有RSF1010质粒的寄主细菌，以增加受体细胞摄取外源DNA的能力。再把R64-1的DNA作为转化DNA，加入含有RSF1010质粒的细菌的培养基中。经过适当的培养后，在含氨苄西林的培养基上选择转化细胞，并分析带有ApR基因的杂合质粒的抗药性性状。结果发现了下列四种不同的情况：

怎样解释这个结果呢？对于表型为ApRSuRSmR的转化细胞来讲，ApR/Tn3可能插入了受体质粒的环状DNA，但没有影响Tn4上SuR和SmR这两个抗性基因的表达，其余三种表型的出现，则表明携有ApR基因的Tn3插入Tn4的不同位置，造成了SuR或SmR基因失活，甚至造成受体质粒RSF1010上的两个抗性基因同时失活。

使用类似的方法，我们可以改造和构筑新的质粒，也可以把Tn转移到细菌的染色体上去。可以设想这种嵌入细菌染色体的转座子是不稳定的，在某种条件下又会游离出来。在这里我们看到一对插入序列就像是重新组合非同源DNA的一种“遗传学按扣”，它们携带了一小段DNA，组成了一个转座子，在一个DNA分子的不同部位，或不同的DNA分子之间跳跃转移，执行着一种或多种我们至今还不甚清楚的功能。只有当它们的活动“出轨”，造成细胞功能“异常”时，才会被我们发现。

转座子所特有的高度能动性的结构基础是什么？DNA分子的电镜观察和核苷酸序列分析表明，所有的转座子两端的核苷酸序列都是反向重复的，称为反向重复序列（inverted repeat sequence，IR）。比如，Tn3的两端有一对长度为38 bp的IR，而接受转座子的目标基因的插入区也有5～9 bp组成的IR，这段IR在Tn插入前并不重复，只是在和Tn插入相伴的DNA复制过程中才合成了另一个拷贝。图7-12显示了目标基因中的IR和Tn中的IR是不同源的。

还有一点要提及的是，有时单个IS序列也可插入DNA分子的某些区段，引起功能基因的钝化或失活，例如，前面提到的dgalm就是一个IS插入。

转座子能动性的分子基础是一对反向重复序列。现已了解这种携有反向重复序列的DNA片段在自然界中广泛存在，有些病毒的原病毒往往也是两端带有端部重复序列的。又如，能引起多种呼吸道疾病的腺病毒，在它的线状DNA分子上就装备了反向重复序列。再如，致瘤的疱疹病毒也被发现带有IR序列。从分子遗传学角度看，研究得最清楚的是逆病毒（retrovirus，又称反转病毒）中的重复序列，下面将专门列题讨论这个问题。

图7-12　Tn插入目标基因时，目标基因复制IR，形成插入反应后Tn两侧的IR序列（引自L.Srtyer）