感受态细胞准备和质粒转化

实验四　农杆菌培养、感受态细胞准备和质粒转化

【实验目的】

1.要求学生掌握农杆菌培养的一般方法。

2.掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

3.掌握农杆菌感受态细胞转化质粒的原理和方法。

【实验原理】

感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低渗氯化钠溶液中，细菌细胞壁通透性增加。转化(transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

受体细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl₂、RbCl和KCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂和KCl法。KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，而CaCl₂法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备的感受态细胞中加入占总体积15%的无菌甘油，可于－70℃保存(半年)，因此CaCl₂法使用方便且更为广泛。

影响转化率的因素包括下面几点:①细胞生长状态和密度;②转化的质粒DNA的质量和浓度;③试剂的质量;④杂菌和其他外源DNA的污染。

本实验以农杆菌LBA4404菌株为受体细胞，用NaCl处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD或者pZY质粒共保温，实现转化。pMD或者pZY质粒携带有抗卡那霉素的基因，因而使接受该质粒的受体菌具有抗卡那霉素的特性，用Kan^r符号表示。将转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含卡那霉素的平板YM培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞因无抵抗卡那霉素的能力而死亡。

【实验器材】

28℃恒温摇床; 28℃恒温培养箱;离心管;天平;冷冻离心机;恒温水浴锅。

【药品试剂】

农杆菌LBA4404;

YM培养基: 0.4g/L酵母提取物; 10g/L甘露醇; 0.1g/L NaCl; 0.1g/L MgSO₄; 0.5g/L K₂ HPO₄; 15g/L琼脂粉，pH值7.2～7.4;

0.1mol/L NaCl溶液(预冷);

20mmol/L CaCl₂溶液(预冷);

50mg/ml卡那霉素;

质粒DNA;

液氮。

【实验方法】

一、农杆菌感受态细胞的制备

1.将农杆菌LBA4404接种在YM(含25μg/ml硫酸链霉素)平板上，26～28℃培养48小时。

2.挑取单菌落接种到5ml YM液体培养基(含25μg/ml硫酸链霉素)中，在28℃条件下，250r/min悬浮培养48小时。

3.取2ml菌液转接于40ml YM液体培养基(含25μg/ml硫酸链霉素)中，在28℃条件下，220r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右，需12小时以上。

4.超净工作台上将菌液转入无菌的50ml离心管中，4℃，5000r/min离心8分钟。

5.弃上清液，用100mmol/L NaCl(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，5000r/min离心8分钟。

6.弃上清液，加入原始农杆菌菌液1/50体积(800ml)的20mmol/L CaCl₂溶液重悬菌体，并分装成200μl/管。

7.将分装后的Eppendorf管置于液氮中10秒，－80℃保存。或者采用下述方法:

1.取－70℃保存的LBA4404于含硫酸链霉素25μg/ml的YM固体培养基上，26～28℃培养48小时。

2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基(含有相应的抗生素)，220r/min，28℃条件下振荡培养12～16小时。

3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基(含有相应的抗生素)中，28℃条件下，220r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右。

4.转入无菌离心管，5000r/min离心5分钟，弃上清液。

5.加入10m l预冷的0.1mol的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟。4℃条件下，5000r/min离心5分钟，弃上清液。

6.加入4ml预冷的含15%甘油的0.1mol/ L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。

7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，200μl/管，置于液氮中10秒，之后于－80℃保存。

二、质粒转化农杆菌

1.将感受态农杆菌LBA4404(200μl/管)置于冰上，加入1μg质粒DNA(质粒体积不超过10μl)。充分混匀后在冰上放置30分钟。

2.置于液氮中1分钟。

3.迅速转入37℃水浴中，待其融化，需3～5分钟。

4.加入1ml YM液体培养基(不含抗生素)，28℃条件下，150r/min，培养2～4小时。

5.将菌液均匀涂布到含有50μg/ml卡那霉素(该抗生素的种类和浓度由转化质粒决定)和25μg/ml硫酸链霉素的YM固体培养基上，在超净台上吹干。

6.28℃培养48小时。

7.挑取单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml硫酸链霉素的液体YM培养基中，28℃条件下，250r/min振荡培养48小时后的菌液用于保存和用于植株的转化。

三、农杆菌转化子的PCR鉴定

1.挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的YM液体培养基中，28℃条件下，220r/min振荡培养16小时。

2.直接用菌液进行PCR鉴定。引物P1和P2需要根据不同的载体而定。PCR反应体系如表1-1所示。

表1-1　菌落PCR的反应体系(30μl)

3.PCR反应: 94℃预变性5分钟，然后开始以下循环反应: 94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟(延伸时间由被扩增基因片段的大小决定，一般按照1000bp延伸1分钟来计算延伸时间)，35个循环后，72℃延伸10分钟。反应结束后，取10μl反应液在1.0%琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。

【思考题】

1.农杆菌感受态细胞制备过程中的注意事项有哪些?

2.影响质粒转化农杆菌的要素有哪些?