线辣椒根系分泌物的-分析

1 研究方案的设计及材料和方法

供试材料为陕西省关中地区线辣椒主栽品种陕椒2006。试验于2010年3～10月在西北农林科技大学进行。在西北农林科技大学新天地试验基地采集连续种植3年线辣椒后的根际土壤作为连作供试土样，采集近3年未种植过线辣椒试验田中的土壤作为正茬供试土样（CK）。XAD-4吸附树脂购于Sigma公司，试验中所用试剂均为国产分析纯。番茄品种为金棚1号。改进配方的Hoagland—Arnon营养液：制备营养液时必须要把大量元素、微量元素以及铁盐分开配置，需要时混配在一起，以免形成沉淀。分为A液（以钙盐为中心）、B液（以磷酸盐为中心）、C液（微量元素）和D液（铁盐溶液）分别保存，A液、B液和D液配置成200倍的母液，C液按配方的500倍配制，需要时分别稀释使用。营养液配方见附录。

线辣椒陕椒2006于3月6日播种，4月20日（幼苗长出第2片真叶时）进行水培并不断用真空通气泵通气。用塑料盆、泡沫板和通气泵自制水培装置，在比盆口稍小的泡沫板上钻30个小孔。选择长势均匀一致的陕椒2006幼苗，根系冲洗干净，茎部用海绵包住定植在泡沫板的小孔中，每孔1株，根系充分浸在培养液中，然后将泡沫板放入水培盆中，再将通气泵的出气管从中间的小孔插入盆中，每盆定植线辣椒幼苗30株，共定植10盆。每盆盛4 L用蒸馏水配制成的1／2剂量的Hoagland营养液。培养10d待幼苗已能够在营养液中正常生长后更换成全剂量营养液。此后每隔10d换1次营养液，保证盆中营养液pH值一致且幼苗正常生长。将更换下来的营养液分盆收集备用。

在营养液中培养30d后，选取植株生长情况基本一致的3盆，取出辣椒苗，用蒸馏水冲洗其根部5次，收集淋洗液，与这3盆每次更换收集的营养液合并到一起，进行过滤，去除杂物后通过XAD-4树脂吸附柱，然后依次用乙醚、乙酸乙酯、甲醇各200m l洗脱根系分泌物，收集洗脱液于旋转蒸发器中，在40℃条件下浓缩至干，最后用10m l甲醇溶解放入-20℃冰箱中保存备用。其余7盆继续培养至苗期60d（即幼苗长出第2片真叶后水培60d）和开花期30d（即水培盆中50%辣椒苗开始开花后水培30d），用同样的方法收集、分离其根系分泌物，但开花期30d只收集水培盆中50%辣椒苗开始开花之后30d内更换的营养液和根系淋洗液（之前的营养液只更换不进行收集），用于根系分泌物的分离。

准确量取根系分泌物液体样品8ml倒于样品瓶（15 mL）中，加盖封口，在30℃水浴中处理10min；将预先在GC-MS仪的进样口经过老化（250℃老化1 h）的固相微萃取器（美国Supelco公司生产）插入瓶中，吸附40min后拔出，插入GC-MS仪（美国Finnigan公司，GC是CE Instruments公司生产的TraceTM 2000型，MS是美国Finnigan，Thermo-Quest公司生产的Voyager型MS）进样口，在250℃条件下解析5min。通过GC-MS分析后得到总离子流色谱图（Total ion chromatogram，TIC），图中各色谱峰通过随机Xcalibur工作站NIST2002标准谱库自动检索得到各组分质谱数据，查阅相关文献资料（何坚和孙宝国1995；刘邻渭2003）及标准色谱图（中国质谱学会有机专业委员会1992）并结合人工分析对机检结果进行比对和确定，采用峰面积归一化法计算各组分相对百分含量，从而得出样品中的具体组分和相对百分含量，每个样品3次重复。

GC的工作条件：色谱柱为DB-WAX（60m×0.25mm×0.25μm）弹性石英毛细管柱（美国Agilent公司生产）；柱温采用程序升温，40℃（保持2.5min），以6℃·min-1升温至230℃（保持7min）；进样口温度250℃；以纯度高达99.999%的He气为载气，不分流进样，流量1.0ml·min-1，进样量1μl。

MS的工作条件：电离方式EI源，离子能70eV，离子源温度为250℃；质量扫描幅度35～400amu，扫描速度0.5s扫全程；发射电流100μA，检测电压1.4 kV。

大田环境中“陕椒2006”根际土壤根系分泌物的测定。于2009年9月25日采集辣椒根际土壤，用内径2cm的土钻，5点法取样，先除去0～2cm的表土，轻轻抖掉根系外围土，再用毛刷轻刷附着在根表面的土壤作为根际土，采样耕层深度为0～20cm，充分混匀，装在事先已灭菌的塑料袋中扎紧，4℃保存。

将采集来的根际土壤自然风干后充分研磨至碎，把杂物摘去，过40目尼龙筛。称取土样100g放入容量为1L的三角瓶中，加入蒸馏水200ml，瓶口封好，振荡18h（130次／min，25℃），之后静置过夜，过滤2次，收集上清液，离心（5000r／min，15min），即为土壤浸提液。经XAD-4树脂吸附柱分离纯化，然后依次用乙醚、乙酸乙酯、甲醇各200ml洗脱根系分泌物，收集洗脱液于旋转蒸发器中，在40℃条件下浓缩至干，最后用10ml甲醇溶解放入-20℃冰箱中保存备用。

2 线辣椒根系分泌物分析的总体结果

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花后水培30d的根系分泌物中分别共检测出相似度（或称匹配度）在70%以上的化合物32、38和41种，相对含量分别占其总量的94.57%、92.93%和88.45%；其中分别有11、11和10种化合物的相对含量很低，在0.20%以下，故忽略不计，相对含量在0.20%以上的物质分别为21、27和31种，相对含量分别占其总量的93.17%、91.31%和86.68%。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤的根系分泌物中分别检测出相似度在70%以上的化合物45和42种，相对含量分别占其总量的89.73%和90.61%。不同环境的线辣椒根系分泌物中所检测出的化合物均可分为8个大类，即：酯类、胺类、烃类、酚类、苯环及杂环类、醇类、酮类和酸类，但各个大类的化合物数量及其相对含量在不同生育期之间、不同环境之间均有较大差异。

3 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中酯类化合物的差异

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花期水培30d的根系分泌物中分别检出6种、7种和5种酯类物质，其中相对含量在0.20%以上的分别为4种、5种和4种（表6-1），总相对含量分别为67.02%、56.19%和59.51%，在8类检出化合物中所占的比例均最大。其中，2-甲基丙酸1-（1，1-二甲基乙基）-2-甲基-1，3-二丙酯的相对含量均最高，分别达56.15%、49.64%和55.03%。3个生育阶段的根系分泌物中，苗期30d的邻苯二甲酸二丁酯的相对含量与其他两个时期的相对含量差异达到显著水平，苗期60d中2-甲基丙酸1-（1，1-二甲基乙基）-2-甲基-1，3-二丙酯的相对含量与另外两个时期的相对含量差异显著，其他酯类化合物的相对含量差异均不显著。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤根系分泌物中分别检出6种和4种酯类物质，其总相对含量分别为16.71%和20.33%，均居8类化合物的第3位，这一相对含量与水培线辣椒根系分泌物中的相对含量相比差距较大，说明不同生长环境在很大程度上影响了线辣椒根系分泌物中酯类物质的分泌。同样，2-甲基丙酸1-（1，1-二甲基乙基）-2-甲基-1，3-二丙酯的相对含量均最高，分别达5.27%和14.65%。

表6-1 线辣椒根系分泌物中的酯类化合物
Table 6-1 Ester compounds in the root exudates of Xianlajiao chilli pepper

（谢振华，赵尊练，2011年）

4 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中胺类化合物的差异

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花期水培30d的根系分泌物中分别检出3种、2种和3种胺类物质，其中前2个生育阶段相对含量在0.20%以上的分别只有2种和1种，而开花期3种物质的相对含量都在0.20%以上（表6-2）。在苗期的两个阶段，胺类物质的总相对含量（8.03%和10.23%）均居8类化合物的第2位；而在开花期30d，其总相对含量（4.38%）居8类化合物的第4位。其中在同一保留时间33.59时，3个阶段所检出的物质相对含量均是胺类化合物中最高的，分别为7.82%、10.23%和3.02%，但物质却不完全一样，互为同分异构体，分别为2，4-二氯苯胺、2，5-二氯苯胺、3，4-二氯苯胺，开花期30d的相对含量分别与不同苗期中的相对含量差异达到显著水平。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤根系分泌物中分别检出2种和1种胺类物质，其总相对含量分别为2.86%和0.43%，位列8类化合物的第6位和第7位，连作土壤中的相对含量明显高于正茬土壤中的相对含量。

表6-2 线辣椒根系分泌物中的胺类化合物
Table 6-2 Amine compounds in the root exudates of Xianlajiao chilli pepper

（谢振华，赵尊练，2011年）

5 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中烃类化合物的差异

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花期水培30d的根系分泌物中分别检出4种、2种和3种烃类化合物，相对含量在0.20%以上的分别为4种、1种和1种（表6-3）。其中在苗期的2个阶段总相对含量较高，达到6.66%和9.39%，均居8类化合物的第3位；而开花期的相对含量很低，居8类化合物的最后一位。说明不同生育阶段烃类物质的总分泌相对含量是存在变化的。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤根系分泌物中分别检出9种和7种烃类物质，其总相对含量分别为15.60%和14.92%，均居8类化合物的第4位，相对含量与开花期水培30d的烃类化合物相比差别较大。

表6-3 线辣椒根系分泌物中的烃类化合物
Table 6-3 Hydrocarbon compounds in the root exudates of Xianlajiao chilli pepper

（谢振华，赵尊练，2011年）

6 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中酚酸类化合物的差异

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花期水培30d的根系分泌物中分别检出4种、3种和4种酚类物质，相对含量在0.20%以上的分别为2种、2种和3种（表6-4）。在苗期的两个阶段，其总相对含量（4.86%和5.95%）比较接近，均居8类化合物的第4位；而在开花期30d，其总相对含量（9.41%）仅次于酯类物质，居8类化合物的第2位。其中，2，4-双（1，1二甲基乙基）-苯酚在三个生育阶段的相对含量均最大，分别为4.59%、5.53%和4.71%；3-（1，1-二甲基乙基）-4-甲氧基-苯酚在开花期30d的相对含量也较高（4.29%），在苗期的两个阶段却均未检出。在线辣椒根际土壤根系分泌物中也未检出酚类物质。

线辣椒水培根系分泌物中酸类物质很少，在苗期水培30d只检出1种，其他2个阶段各检出3种，总相对含量分别为0.59%、1.21%和3.16%（表6-4），不同生育阶段之间差异较大。其中，公认的化感物质邻苯二甲酸在苗期和开花期30d都出现了2次，但苗期两次的相对含量都很低，开花期30d有1次的相对含量稍高一点（1.48%），而在苗期60d则未检出；4-（对甲氧亚苄基）-肉桂酸在开花期30d也出现了两次，但相对含量也都很低。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤根系分泌物中分别检出6种和7种酸类物质，其总相对含量分别为21.03%和20.99%，均居8类化合物的第2位，且连作土壤中的相对含量均明显高于正茬土壤中酸类物质的相对含量，这与文献中所说的连作土壤中酚酸类物质相对含量较多相一致（胡元森等2007；张淑香等2000）。公认的化感物质邻苯二甲酸相对含量均较高（4.82%和1.18%），香草酸（6.78%和4.65%）和对羟基苯甲酸（4.67%和2.85%）的相对含量也都比较高。

表6-4 线辣椒根系分泌物中的的酚类和酸类化合物
Table 6-4 Phenol and acid compounds in root exudates of Xianlajiao chilli pepper

续表

（谢振华，赵尊练，2011年）

7 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中苯及其他杂环类化合物的差异

在线辣椒苗期水培30d、60d和开花期水培30d的根系分泌物中分别检出10种、17种和19种苯及其他杂环类化合物，相对含量在0.20%以上的分别为5种、11种和13种（表6-5），但每种物质的相对含量均很低，最高的只有1.64%，3个生育阶段均有的物质只有4种，各阶段化合物之间差异均不显著。

在线辣椒连作土壤和正茬土壤根系分泌物中均检出14种苯及其他杂环类化合物，其总相对含量分别为25.56%和23.81%，在8类检出化合物中所占的比例均最大，两类土壤中的相对含量比较接近。

表6-5 线辣椒根系分泌物中的苯及其他杂环类化合物
Table 6-5 Benzene and heterocyclic compounds in the root exudates of Xianlajiao chilli pepper

续表

（谢振华，赵尊练，2011年）

8 线辣椒水培环境和大田环境根系分泌物中醇类和酮类化合物的差异

水培线辣椒根系分泌物中醇类物质和酮类物质均较少，每种物质的相对含量也较低（表6-6）。在3个生育阶段都检出了雪松醇，其相对含量在醇类和酮类物质中也最大，分别为1.63%、1.94%和1.75%，其他醇类和酮类化合物的相对含量均在0.65%及其以下。

在线辣椒连作土壤根系分泌物中均检出4种醇类和酮类物质，其总相对含量均较少，分别为4.41%和3.56%，而在正茬土壤根系分泌物中分别检出4种和5种醇类和酮类物质，相对含量稍高于连作土壤中的（4.86%和5.27%），已研究证明的化感物质香草醛两类土壤中均包含，只是相对含量较低（0.49%和0.31%）。

表6-6 线辣椒根系分泌物中的醇类和酮类化合物
Table 6-6 Alcohol and ketone compounds in the root exudates of Xianlajiao chilli pepper

（谢振华，赵尊练，2011年）