线辣椒与其他辣椒的亲缘关系研究

为了探索线辣椒与其他类型辣椒的亲缘关系，作者与研究生于2011年设计了专门的试验。本试验选择具有一定代表性的20份辣椒资源，其中灯笼椒2份，羊角椒2份，朝天椒2份，线辣椒材料13份，上述材料均属于Capsicum annuum L.种，同时选择C.chinense材料1份。试验材料详见表1-1。

研究采用随机扩增多态性（RAPD）和简单序列重复多态性（SSR）2种分子标记，对20份辣椒种质资源（其中线辣椒13份，其他辣椒资源7份）的遗传多样性进行了分析，同时将分子标记的结果与形态标记结果进行了比较。

表1-1 辣椒材料的编号及类型
Table 1-1 Designations and the types of Capsicum accessions

（武国平，赵尊练，2011年）

应用MVSP3.13f软件，根据Nei＆Li的方法计算各种质间的相似系数（GS），采用UPGMA（unweighted pair group method using an arithmetic average）方法进行聚类分析。利用POPGENE32软件计算RAPD扩增产物的多态位点数、多态位点比率、标记系统的有效等位基因数（effective number of alleles，NE）。相似系数（Genetic Similarity）GS＝2Nij／（Ni＋Nj），式中：Nij为材料i和j共有的扩增片段数目，Ni为材料i中出现的扩增片段数目，Nj为材料j中出现的扩增片段数目。

1 RAPD标记分析

1.1 主要试验方法

PCR扩增用的TaqDNA聚合酶、10×Buffer、MgCl2、dNTP均购自西安沃尔森生物公司。10个碱基随机引物和SSR引物购自上海生物工程有限公司。扩增用的热循环仪为PTC-100（Bio-Rad公司生产）。平板电泳槽电泳仪购自北京君意仪器厂。电泳结果用UVP紫外扫描成像系统观察记录。聚丙烯酰胺凝胶电泳系统装置购自北京君意仪器厂。每份材料随机选取5株取样，每株取生长点新鲜嫩叶2片。PCR扩增反应体系为buffer为2.5μl，镁离子2μl，dNTP为0.65μl，Taq酶0.35μl，引物2μl，模板DNA 1μl，ddH2 O 16.5μl，共计25μl。扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50 s，34℃或38℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环，72℃延伸10min。采用1.6%的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外成像系统上进行观察并拍照。每个RAPD引物检测3～10个位点，每条多态性带视为1个等位基因，将观测到的每条带视为1个性状，强反应带记为“1”，弱反应带重复出现记为“1”，弱反应带出现但不重复记为“0”，无带记为“0”。

1.2 RAPD产物的多态性及引物的多态性信息含量

本试验选取甜椒C6及朝天椒、陕椒2006进行引物筛选，按照条带清晰、多态性好、重复性好的标准，从60个随机引物中筛选出37个引物，引物753的RAPD扩增图谱见图1-1。不同引物扩增的结果在总带数、多态性带数、带型及带的亮度等方面都表现出了差异。从60个引物中筛选出37个带型好、多态性较高、重复性好的随机引物作为RAPD分析的引物（见表1-2）。

图1-1 引物753对辣椒材料的RAPD扩增图谱

Fig.1-1 The RAPD pattern of 20 pepper resources amplified by primer 753
1～20为供试材料编号，其对应材料名称见表2-1；M为2000 bp Marker；下同。
1～20 are thematerial number；M 2000bp marker.The same as below.

表1-2 所用的RAPD引物
Table 1-2 The RAPD primers in this study

续表

（武国平，赵尊练，2011年）

从表1-2可以看出，37个RAPD引物共产生218个位点，其中168个位点有多态性，占总条带数的77.17%。每个引物可扩增3～10个位点，平均每个引物产生5.7个位点，其中引物R761的多态性位点数最高，为11个。产生多态性的随机引物其所有扩增产物都用于分析，并将每条扩增带看作1个等位位点。

从表1-2中可以看出，37个引物多态性百分率为50%～100%，平均80.17%。以引物R763、R764、R4、R5、R11多态性百分率最高为100%，引物R13值最低为50%。引物等位位点多态性信息含量PIC变幅为0.6739～0.8438，平均为0.7951。R753的多态性信息含量最高为0.8438，R13的PIC最低均为0.6739。

1.3 依据RAPD产物信息的聚类分析

根据RAPD分析所得数据聚类并作图1-2。

图1-2 辣椒品系（种）RAPD聚类树状图
Fig.1-2 The tree diagram of 20 pepper based on RAPD markers by UPGMA

由图1-2可见，在遗传距离GD值0.75水平上，供试的20份辣椒聚成3大类。

第一大类由2个亚类组成，第一亚类包括甜椒2个材料为甜椒C6、CD12；第二亚类包括2个角椒材料，为角椒C15、C4。

第二大类由樱桃椒2个材料组成，包括樱桃椒G1-2、G4-1。

第三大类由2个亚类组成，第一亚类包括线辣椒11个材料，为线辣椒2号、4号、D2-2、L14-6、E、陕椒2006、D26-5、D26-7、D30-1、7号、9号。第二亚类包括线辣椒D6-4、D1-1。

第四大类仅由一个材料组成，为Chinense。

根据Nei-Li系数计算出供试材料的遗传距离可以看出，20份辣椒材料间遗传距离变化范围为0.61～0.90。其中线辣椒-E和陕椒2006遗传相似系数最大为0.90。

2 SSR标记分析

2.1 主要试验方法

PCR扩增用的TaqDNA聚合酶、10×Buffer、MgCl2、dNTP均购自西安沃尔森生物公司，10个碱基随机引物和SSR引物购自上海生物工程有限公司，扩增用的热循环仪为PTC-100（Bio-Rad公司生产），平板电泳槽电泳仪购自北京君意仪器厂，电泳结果用UVP紫外扫描成像系统观察记录，聚丙烯酰胺凝胶电泳系统装置购自北京君意仪器厂。每份材料随机选取5株取样，每株取生长点新鲜嫩叶2片，混合后放入密封袋，放入冰盒送至实验室，用改良的CTAB法提取总基因组DNA。PCR扩增反应体系为buffer1.5μl，镁离子1.2μl，dNTP为0.4μl，Taq酶0.2μl，上下游引物各0.6μl，模板DNA 0.6μl，ddH2O 9.9μl，共计15μl。扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50 s，55℃或58℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

对扩谱进行数据统计，每对SSR引物检测3～8个位点，有此带时记为“1”，无此带时记为“0”。依据欧氏距离法计算群体内的遗传变异系数。

2.2 SSR产物的多态性及引物的多态性信息含量

本试验选取甜椒C6及朝天椒、SJ2006进行引物筛选，按照条带清晰、多态性好、重复性好的标准，从60对SSR引物中筛选出33对引物。引物139对辣椒材料的SSR扩增图谱见图1-3。

图1-3 引物139对辣椒材料的SSR扩增图谱
Fig.1-3 The SSR pattern of 20 pepper resources amplified by primer 753

表1-3 所用的SSR引物
Table 1-3 The SSR primers in this study

（武国平，赵尊练，2011年）

从表1-3可以看出，33对SSR引物共产生158个位点，其中129个位点有多态性，占总条带数的80.16%。每个引物可扩增3～10个位点，平均每个引物产生4.8个位点，其中引物SSR123的多态性位点数最高，为8个。产生多态性的随机引物其所有扩增产物都用于分析，并将每条扩增带看作一个等位位点。

从表1-3中可以看出，33对引物多态性百分率为50%～100%，平均80.17%。以引物SSR43、SSR222、SSR62、SSR155、SSR172等多态性百分率最高为100%，引物SSR004值最低为50%。引物等位位点多态性信息含量PIC变幅为0.6757～0.8433，平均为0.8017。SSR18的多态性信息含量最高为0.8438，SSR274的PIC最低均为0.6739。

2.3 依据SSR产物信息的聚类分析

20份辣椒材料SSR标记聚类树状图见图1-4。

图1-4 20份辣椒品系（种）SSR聚类树状图
Fig.1-4 The tree diagram of 20 pepper strains based on SSR markers by UPGMA

20份辣椒材料遗传相似系数（GS）在0.63～0.88之间，平均为0.755。其中陕椒2006与线辣椒-E的遗传相似系数最大，为0.91，说明2个材料之间亲缘关系及遗传距离最近。在D＝0.75时，可将20份辣椒材料分为3大类群：第一类群包括甜椒、角椒、朝天椒各2份，两份角椒材料的GS值较大，为0.85。第二类群为13份线辣椒材料，在D＝0.81处，这13份材料又被分为5个亚类，第一亚类包括线辣椒2号、L14-6、4号、D2-2，其中2号和L14-6的GS值较大，为0.84，说明这2份线辣椒材料遗传距离较近；第二亚类包括陕椒2006、线辣椒-E和D26-7，其中陕椒2006与辣椒-E的遗传距离较近，GS值高达0.91；第三亚类包括线辣椒7号、9号、D30-1和D26-5，其中7号和9号的GS值较大，为0.85；第四和第五亚类分别包括一个材料，为线辣椒D1-1和D6-4。第三类群包括一份材料，即C.chinense。

3 形态指标标记分析

3.1 主要形态指标及其记载观察依据

参照UPOV（International Union for the Protection of New Varieties of Plants）、AVRDC（亚洲蔬菜研究和发展中心）和IPGRI（The Intenrational Plant Genetie Resourees Institute）推荐的关于辣椒农艺性状描述及赋值标准（Leefbvre et al.2001；AVRDC 1997；IPGRI 1995），见图1-3～图1-5，结合实际制定线辣椒植物学性状调查标准（表1-2，表1-3）。

图1-5 果型（引自Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）
Fig.1-5 Fruit shape（Photo from Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）

图1-6 果肩形状（引自Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）Fig.1-6 Fruit
shape at Pedicel attachment（Photo from Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）

图1-7 果尖形状（引自Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）
Fig.1-7 Fruit shape at blossom end（Photo from Descriptors for Capsicum（Capsicum spp.）IPGRI 1995）

表1-4 辣椒植物学性状调查的项目及标准
Table 1-4 Themain moephological characters and their criteria for pepper characterization

（武国平，赵尊练，2011年）

表1-5 形态性状及其编码
Table 1-5 Phenotypic traits and their coding

（武国平，赵尊练，2011年）

3.2 依据依据形态指标的聚类分析

根据表1-3中所列的24个形态指标，对20份辣椒材料进行聚类分析，结果见图1-8。

图1-8 20份辣椒品系（种）形态标记聚类树状图
Fig.1-8 The tree diagram of 20 pepper strains based on phenotypic traitsmarkers by UPGMA

图1-8表明，20份材料的遗传相似系数在0.54～0.96之间。其中甜椒C6与甜椒CD12的GS值最大，为0.97。在D＝0.75处，将20个供试辣椒种质聚为4大类群。

第一类群包括甜椒和角椒各2份，为甜椒C6、CD12，角椒C15、C4。其中2份甜椒材料之间GS值较大，除果实颜色不同外，其表型形状均相同；而两份角椒材料则果实纵径大小不同。

第二类群包括2份樱桃椒材料，为樱桃椒G1-2、G4-1。与其它18份辣椒材料不同之处为果实朝上生长。

第三类群包括13份线辣椒材料，其果实形状均为长形，植株高度均相对较高。在D＝0.86处，这13份线辣椒材料又被聚为5个亚类：第一亚类包括线辣椒2号、D30-1、L14-6，其果实果肉均较厚；第二亚类包括线辣椒7号、SJ2006、线辣椒-E、D26-5、D26-7等5份材料，其果实为簇生型；第三亚类包括线辣椒4号和9号，其果实味道较辣；第四亚类包括线辣椒D2-2，其植株高度较高；第五亚类包括线辣椒D6-4和D1-1，其株型松散。

第四类群为C.chinense，其株型松散，果实形状为风铃型，植株高度较矮，叶面积较小。

4 RAPD、SSR和形态学标记聚类之间的相关性研究

用SPSS11.0软件的双变量（Bivariate）相关分析法对上述4组遗传相似系数矩阵进行相关分析，结果（表3-3）表明，RAPD标记与SSR标记的相关系数为0.902，RAPD＋SSR标记与SSR标记的相关系数（0.830）较RAPD标记的（0.785）要高，这与SSR标记的多态性位点比率比RAPD标记的高有关，也表明整合后能提供更丰富的信息。RAPD标记与表型性状标记的相关系数为0.743，SSR标记与表型性状标记的相关系数为0.710，RAPD＋SSR标记与表型性状的相关系数为0.658，均达到了显著水平。

表1-6 分子标记与形态标记之间的相关系数
Table 1-6 The correlation coefficients amongmolecularmarkers and phenotypic traitsmarkers

（武国平，赵尊练，2011年）

上述结果说明，这3种标记方法及其对于本研究所选取的20份辣椒品种（资源）的聚类结果具有较高的相似性，说明分子信息与形态信息具有一定的相关性，同时也间接地证明了表现型＝遗传＋环境。

尽管美国等部分国外的学者认为，中国学者所说的线辣椒、牛角椒、小辣椒、灯笼椒等类型均属于不同的pod type（果型）。但是，根据作者多年的系统观察，这些不同类型的辣椒不仅在果型上存在明显的差异，而且在株型、叶形、抗病性、耐寒性等方面也存在着系统的差异且许多性状的遗传传递相对稳定。所以，我们的这种划分方法及其各类型之间遗传关系尚有进一步研究的价值。