基因敲除技术

（一）基因敲除技术的发展及应用

现代生命科学的研究发展趋势是由分子水平的研究向整体水平的研究回归。人类基因组计划这一项伟大工程自1990年启动至2001年为止，测序工作已经基本完成。但是，人们发现这仅仅是人类认识自身的一个开始。因为人类基因组及多种模式生物基因组的测序产生了编码3万～4万个基因的核苷酸序列，其中只有少数基因能够真正表达，而且其表达受到内外环境等因素的调控，所以人类只是对其中一小部分基因的作用是已知的。由于基因组研究并不能表明人类的哪些基因在何时何地以何种程度表达，因此基因组计划开始转移到蛋白质组的研究。蛋白质组主要采用双向凝胶电泳、双向高效柱层析、质谱技术和生物信息学方法对特定时间特定组织中所有蛋白质进行分析、氨基酸测序等。基因组学和蛋白质组学的共同特点是对生命现象进行大规模的研究，为生命科学的发展打下了基础，但距离真正的目标，认识生命过程的精细机制，还有很大的距离。

基因功能的研究将成为基因组计划完成后面临的又一重大课题，通过改变该基因的表达，然后观察其对其他基因的影响，以及对表型的影响。改变基因表达有两个方向：一个是增强其表达，另一个是减弱或者彻底终止其表达。现代基因敲除技术（gene knockout）是研究上述问题的很好工具，通过它可以对一个结构已知但功能未知的基因，利用分子生物学技术增强或减弱其表达水平，然后观察实验动物整体功能状态的变化、推测相应基因的功能。这项技术是将基因与其整体功能联系起来的重要研究方法，类似于早期生理学研究中切除部分组织器官，观察整体功能状态，推测功能的思想。而转入新的基因或者加强某一基因的表达又类似于注射药物，观察整体，推测功能的方式。条件基因敲除技术（conditional gene　knockout）是在基因敲除基础上结合Cre/Lox P系统而形成的，它可以做到在特定的组织或是细胞中将靶基因删除，从而可以真实反映特定组织或是细胞中靶基因被删除或是修饰后的结果。

（二）条件基因敲除技术

1987　年，Capecchi研究小组根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”（gene targeting）。这一技术也可用于定点灭活一个内源基因，称为“基因敲除”（gene knockout）。这种方法是完全基因敲除，也就是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者是动物个体内的活性完全消除。然而完全基因敲除使小鼠所有细胞基因组上都存在基因的缺失或突变，有些重要的靶基因敲除或导入会导致动物的胚胎早期死亡或严重的发育缺陷而导致该突变无法传代，不利于在小鼠各个发育阶段进行该基因功能的分析。为了克服这一弊端，必须要找到一种可以人为控制基因在特定发育阶段表达或敲除的方法。1993年，Gu等应用Cre/lox P重组酶系统实现了外源基因的时间特异性表达，在此基础上，条件基因敲除技术得以形成。条件基因剔除的基本原理是利用一种位点特异性的重组酶Cre。Cre是一种主要存在于低等生物体中的重组酶，但在哺乳动物细胞中能有效地发挥作用。这个酶的特点是可特异性识别具有34个碱基的不对称的核酸序列lox P，使得两个位于lox P之间的序列发生重组。Cre/lox P系统首先是使目的基因位于两个同向的lox P位点之间，然后在ES细胞内发生同源重组，选择性标记筛选后，将其注入胚囊中，最后再注入假孕小鼠子宫内以繁殖转基因小鼠。这与传统的剔除技术一样，但是产生的小鼠却与正常小鼠表型一致，仅在基因组上的目的基因的两端含有lox P位点。当Cre出现时，lox P位点间的目的基因被剔除。因此这个系统不但需要目的基因位于lox P位点间的转基因小鼠，还需要Cre转基因小鼠。将Cre序列的前端插入组织特异性的启动子，就使得Cre在特定的组织或细胞中表达，导致这些组织或细胞中的靶基因被特异性地删除，而其他组织或细胞中Cre不表达，靶基因不会被改变，也就形成不同组织特异性的Cre转基因小鼠。因此，当目的基因位于lox P位点间的转基因小鼠与组织特异性的Cre转基因小鼠交配后，则目的基因就可在特异的组织中被剔除，达到了剔除组织类型上的控制。

第1步：在基因重组后基因组上目的基因的两端含有lox P位点。第2步：重组酶Cre特异性识别具有34个碱基的不对称的核酸序列lox P，使得两个位于lox P之间的序列发生重组。

1．Cre/lox P条件基因敲除

（1）Flox－and－delete：是将靶位点用方向相同的lox P位点锚定后通过与组织特异性Cre转基因小鼠杂交，而使靶基因在特定组织或是细胞被切除（图28－2）。

（2）Flox－and－replace是用另一个基因或是基因片段，以考察在特定性组织或是细胞中新的基因能否取代靶基因的功能。

（3）Flox－and－invert是前者的一种变化，将靶位点两侧的lox P位点序列反向，靶位点序列没有被删除但是已经没有功能。这种方法采用动物本身的组织特异性启动子。随着组织特异性启动子的发现和应用，逐步实现了组织特异性的基因打靶和基因敲除。此外这个系统还可以在时间上控制Cre的重组，通常的方法是将Cre与特异性配体的结合序列相融合，这样Cre的作用将依赖外源性配体的介入。当Cre融合配体结合序列的转基因小鼠与目的基因转基因小鼠交配后，在任何时间，注入相应的配体，就可使目的基因在特异的时间内被剔除，达到了剔除时间上的控制。因此，Cre/lox P系统具有在时间和位置上均可控制的优点，可以准确地了解目的基因在体内的功能，目前已经被广泛地应用。

图28－2　Cre－lox P打靶策略

除了Cre/lox P重组酶系统之外，还有其他系统可以进行组织特异性Cre重组酶转基因小鼠的制备，这些系统可以将Cre基因在不同发育阶段小鼠中的表达进行诱导，对靶基因在时间上实现调控。这些系统常用的有：四环素诱导系统、Tamoxifen激活系统和RU486激活系统。

2．四环素诱导系统（tet systems）　是目前研究最多的诱导表达系统。在这个系统中包括两种转基因：四环素控制的转录激活物（tTA）和tTA依赖的启动子（tetO）转基因。tTA是四环素的抑制物和单纯疱疹病毒VP－16的C末端部分拼接体。tTA依赖的启动子则是RNA聚合酶Ⅱ的启动子和四环素操纵子的拼接体，这些启动子下游则是被调节的目的基因。在缺乏四环素（tet）或其衍生物强力霉素（Dox）时，tTA与tetO序列结合，使得其下游目的基因激活。然而当四环素存在时，四环素与tTA结合，使得其不能与它的靶序列结合，因此不能发生转录。因为四环素的出现使得转录下调，所以使用tTA的tet systems叫tet off。因为动物体内通常没有内源性的四环素及其衍生物，所以可以通过注入外源性的四环素及其衍生物，从而在时间上可以使目的基因的表达得以控制。而Dox又因与tTA的结合能力强，毒性小，故而在实际中经常应用。tet off也存在一定的缺点，如果只在小鼠成年时才诱导目的基因，以防止目的基因的表达，则该小鼠自胚胎期至成年期必须持续喂养足够量的Dox。而长期喂养这类抗生素可导致一些不良反应。有研究表明，在发育中如果始终接触Dox，可导致小鼠的空间记忆能力的减弱和容易受惊吓等症状。而且受诱导的器官不同，所需的剂量也不尽相同，所以这个系统操作起来比较麻烦。针对以上问题，另一种tTA的突变体rtTA得以出现。与tTA不同的是，rtTA是当Dox出现时，目的基因方能转录，因此这个系统叫做tet on。这个系统中，抗生素直接在体内起作用，而不像tet off还须抗生素在体内的清除过程，因此作用更快。但在这个系统中，在没有Dox的情况下，rtTA也可与tetO有微弱的结合，导致目的基因有一定的基础表达，因此也有一定的缺陷。针对rtTA有基础表达的这个缺陷，又产生了几种rtTA的改进方法。TTSkid 和tTR是两种改进的tet的抑制物，当与rt－TA共同存在时，它可与之相互作用，从而抑制了rtTA的基础表达；当tet诱导时，tet与TTSkid和tTR结合，从而使tetO位点暴露，rtTA与之结合，从而使下游基因表达。因而在这个系统中，不存在基础表达，但是这个系统需要三种转基因小鼠，所以还是比较麻烦。同时又有两种新的rtTA突变体Rt－TA2sm2和rtTE，它们的作用与rtTA相比，对tet更敏感，转基因的效果更稳定。目前除了四环素诱导系统外，还有蜕皮素诱导系统和细胞色素P450诱导表达系统。

随着大量人类遗传疾病小鼠动物模型的诞生，人类在快速有效地制造疾病动物模型的基因技术上也有长足的发展。在小鼠中应用专一位点重组酶进行单个基因的条件敲除的技术是在特定组织，后基因组时代研究哺乳动物基因复杂功能的一个极其有效的方法，然而产生在基因特定位点中带有重组酶识别顺序的过程是很费时费力的，而且技术上也有难度。因此人们建立了一种新的方法，它可以结合基因捕捉和特定位点DNA倒位来形成小鼠胚胎干细胞克隆，应用于快速条件基因敲除小鼠的生成。这个方法可以选择成千上万种带有精确插入的胚胎干细胞来生成条件基因敲除小鼠，避免了耗时的打靶载体的构建和每个基因进行同源重组的步骤。

（三）核糖核酸干扰技术

核糖核酸干扰技术（RNA interference，RNAi）为现今广泛用于降解特定基因的一种技术，但受限于诸多技术上的限制，例如无法局限作用于特定组织及无法适时诱发基因降解等，因此一直未能应用于遗传疾病小鼠。有鉴于建立遗传疾病小鼠对于医药研发的重要性，着手开发适用于建立遗传疾病小鼠之核糖核酸干扰技术，经结合核糖核酸干扰、重组（recombination）、四环素诱导（tetracycline inducement）及胚显微注射（embryonic microinjection）等技术，现已成功建立因ABCA1基因缺陷所导致之遗传性疾病Tangier disease之基因转殖小鼠。经细胞及血液学上的测试，于四环素诱发整个基因降解系统后，受试小鼠肝细胞中发生基因重组并干扰ABCA1（ATP－binding cassette　sub－family A1）基因的正常表现，在ABCA1降解后小鼠肝中胆固醇酯大量蓄积，进而导致血液中胆固醇明显下降，此生理及病理现象与人类遗传疾病Tangier是相类似的，试验结果显示该系统确实适用于建立多种遗传疾病小鼠，并可于日后提供药物开发及测试之用。这个系统的出现可以快速地建立人类遗传疾病的动物模型，不需要应用繁琐费时的胚胎干细胞和基因打靶技术，是研究人类遗传疾病的新工具。

条件基因敲除技术的出现，避免了许多重要基因敲除后动物在胚胎期的死亡，实现了特定组织器官和特定细胞疾病的研究。

（侯昭晖　杨仕明）