（一）组织切片及预处理
1.将石蜡切片置65℃烤箱烘干。
2.二甲苯脱蜡入水。
3.0.01mol/LPBS洗5min×2次。
4.0.02mol/LHCl洗5min。
5.0.01mol/LPBS洗5min。
6.滴加蛋白酶K（20μg/ml）37℃温箱孵育消化10～20min。
7.0.01mol/LPBS洗5min×2次。
8.入4%多聚甲醛10min，0.01mol/LPBS洗5min×2次。
9.室温干燥。
（二）杂交
1.滴加杂交液（50μl/张，地高辛标记的探针）放入50%甲酸胺湿盒内，加硅化盖玻片。
2.置42℃温箱中孵育杂交过夜。
（三）洗涤及显色
1.入50%甲酸胺液。
2.入2×SSC10min。
3.入2×SSC20min。
4.1×SSC洗10min，37℃。
5.1×SSC洗10min，室温。
6.封闭 TitonX-1001.5μl＋NSS（双蒸水）10μl，室温30min。
7.滴加抗体复合物 TitonX-1001.5μl＋NSS5μl＋dig-AP1μl（碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体），37℃1h。
8.显色 左旋咪唑0.24mg＋NBT4.5μl＋BCIP3.5μl，1～48h。
9.双蒸水5min。
10.核染色（需要时甲基绿染胞核）。
11.常规脱水、透明、中性树胶封片、镜检。
（四）结果
阳性部位呈蓝紫色颗粒沉淀（图3-19）。
图3-19 肾小管TIMP-1mRNA表达（×400）
[1]Zhang X,Chen X,Hong Q,et al.TIMP-1 Promotes Age-Related Renal Fibrosis Through Upregulating ICAM-1 in Human TIMP-1 Transgenic Mice.J Gerontol A Biol Sci Med,2006,61:1130-1143.
[2]师锁柱，田月，陈庆砾，等.肾脏标本的原位杂交与免疫组织化学双标记技术.中华肾脏病杂志，2002,18:446-447.
[4]师锁柱，田月，董建平，等.系膜增生性肾小球肾炎组织中TIMP1mRNA 及蛋白的表达.军医进修学院学报，2002,23:318.
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