基因工程的操作步骤

5．基因工程的操作步骤

第一步：目的基因的制取。用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或将被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法。

第二步：基因载体的选取。用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。

基因克隆载体必须具备三个条件：①具有能使外源DNA片段组入的克隆位点；②能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制；③必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。

第三步：DNA的体外重组。即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。

第四步：DNA重组体导入受体细胞：将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体，即重组DNA。这种重组体连接的方法主要有黏性末端连接法和钝性末端连接法两种。

黏性末端连接法：应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子，可产生相同的黏性末端（接口处的碱基互补），进一步用DNA连接酶将断口连好，即可获得重组DNA分子。

钝性末端连接法：用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段，均为钝性末端，这种末端也可以用特殊的连接酶连接，但效率太低。通常需要用人工方法加上黏性末端，再进行连接。

第五步：受体细胞的繁殖扩增。含重组DNA的活受体细胞，再在适当的培养条件下，并进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。

第六步：克隆子的筛选和鉴定。受体细胞经转化（传染）或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子，一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。

第七步：目的基因的表达。