蛋白质标记与双向电泳

（一）实验目的与主要实验原理

双向电泳是利用蛋白质的等电点特性和分子量特性，对蛋白质分离的技术。通常先进行等电聚焦电泳（按照等电点分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子量大小分离），最后经染色得到蛋白质两维图谱。荧光差异显示-双向电泳技术是在双向电泳基础上发展起来的新技术，其通过对蛋白质进行荧光标记（Cy2，Cy3和Cy5），提高了检测的灵敏度。同时，它还使用了内参照的方法，提高了实验的准确度。

（二）实验材料

蛋白质裂解液，IPG buffer，24cm pH3-11NL胶条，聚丙烯酰胺凝胶等。

（三）实验步骤

1.蛋白质的提取及荧光标记　从-80℃冰箱中取出组织标本，用DIGE裂解液[30mmol/LTris，7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%（w/v）CHAPS，pH8.5]进行裂解。取出50μg的蛋白质，用裂解液补充体积至30μl，加入1μl工作液［工作液配方：1倍体积1mmol/L（Cy3或Cy5）+1.5倍体积的二甲基甲酰胺，浓度为400pmol/μl］，避光冰浴30min，加入1μl10mmol/L赖氨酸终止反应，4℃10min，-80℃避光保存，内参标记：从每个样本中各取出25μg的蛋白质混合，用上述方法标记Cy2，每块胶上样50μg标记内参。上样方法：将1份内参，1个Cy3标记的标本，1个Cy5标记的标本混合后，进行双向电泳。

2.双向电泳　取出上述标记好的蛋白质，加入等体积的2×上样缓冲液[7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%（w/v）CHAPS，130mmol/LTT，1%IPG]，冰浴15min，加入270μl水化液[7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%（w/v）CHAPS，65mmol/LDTT，0.5%IPG]，总体积为450μl。

取24cmpH3～11非线性胶条，放入24cmIPG持胶槽中，加入上述配制好的混合液，上面覆盖液状石蜡防止蒸发。设置等电聚焦条件：30V12h，梯度升压到200V6h，梯度升压到500V3h，梯度升压到10000V1h，保持10000V6.4h（可以根据实际需要调整）。

取出等电聚焦好的胶条，用平衡液A（50mmol/L Tris-HCl，pH8.8，6mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，10mg/ml DTT）振荡平衡15min，再用平衡液B（25mg/ml碘乙酰胺代替DTT，其余成分不变）振荡平衡15min，然后将IPG胶条置于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向SDS-PAGE电泳，采用26cm×20cm的12.5%的聚丙烯酰胺凝胶（表2-19），电泳参数为2W/gel1h；5W/gel过夜至溴酚蓝到底。取出电泳好的胶板，放入Typhoon扫描仪中，扫描参数如下：激发光Cy2488nm，Cy3532nm，Cy5633nm，PMT设定范围510～520nm（表2-20）。

表2-19　12.5%聚丙烯酰胺凝胶配制方法

表2-20　DIGE结果扫描参数

3.分析差异表达蛋白质 利用分析软件（不同公司所配软件不同），找到差异蛋白质点。

（四）注意事项

1.用蛋白质裂解液裂解组织后，用pH试纸检测pH，为了保证后续的荧光标记，pH应在8.0～8.5，如果pH太低或太高，则需要用盐酸或氢氧化钠调整。

2.一定要使用高纯度二甲基甲酰胺（>99%），以保证荧光标记效果。

（五）主要问题及解决方法

1.为什么没有标记上荧光？

答：这可能与蛋白质溶液的pH以及二甲基甲酰胺的纯度有关，一定要保证蛋白质溶液的pH在8.5左右，并保证使用高纯度的二甲基甲酰胺。

2.为什么双向电泳时出现横向的条纹？

答：这与一相等电聚焦过程有关，可能与样品中盐浓度过高，等电聚焦条件不适合有关。解决方法：可以将蛋白质样品利用纯化试剂盒进行纯化，去除过多的盐分，后进行标记；同时调整等电聚焦的条件（可以增加时间），以达到最好的分离效果（注意：荧光染料非常昂贵，因此，必须先用不标记荧光染料的蛋白质进行双向电泳预实验，等条件成熟后，再实施荧光标记，开始正式实验）。