醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质

【实验目的】

掌握电泳法分离血清蛋白的原理，并熟悉基本操作技术。

【实验原理】

带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。蛋白质为两性电解质，在不同pH条件下，其带电情况不同。在等电点时，蛋白质为兼性离子，其净电荷为零，不发生泳动。蛋白分子在pH小于其等电点的溶液中，呈碱式解离带正电向负极泳动。在pH大于其等电点溶液中，则呈酸式解离带负电，泳向正极。带电粒子在电场中的泳动速度常用迁移率来表示。它除与电场强度、溶液的性质等有关外，主要决定于分子颗粒的电荷量以及其分子的大小与形状等。电荷较多，分子较小的球状蛋白质泳动较快。

血清中各种蛋白质的等电点均低于7，故在pH　8．6缓冲液中，均带负电荷。由于各种蛋白质的等电点不同，带电荷量不等，加之分子量不同，导致在电场中泳动速度不同，从而加以分离。清蛋白泳动最快，其次依次为α1、α2、β及γ球蛋白。将蛋白质固定染色后，洗去多余染料，可看到清晰的色带。将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中，可进行比色分析，计算出各种蛋白质的百分含量，或用光密度计进行扫描定量。

【实验器材】

电泳仪（稳压器）；电泳槽；分光光度计；点样器（1．4cm×1．8cm的X线片）；血清（放置于载玻片上）；醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）

【实验试剂】

1．pH　8．6　0．06M巴比妥缓冲液　取巴比妥1．62g，巴比妥钠12．38g，用蒸馏水加热溶解冷却后加水至1　000ml。测试pH，若pH偏离8．6，可用lmol／L HCl或NaOH校正。

2．染色液　下列任选其一：

（1）氨基黑l0B1g，三氯醋酸13．4g，磺柳酸13．4g，蒸馏水加至1　000ml。

（2）丽春红2R0．8g，溶于6%三氯醋酸100ml中。

3．漂洗液

（1）3%冰醋酸溶液（用于氨基黑染色）

（2）2．5%醋酸溶液（用于丽春红染色）；

4．洗脱液　0．4mol／L NaOH溶液。

5．透明液　冰醋酸30ml，无水乙醇70ml，醋酸乙酯1ml混匀。

【实验方法】

1．准备　电泳槽内放适量的缓冲液于两侧。液槽间放一充满缓冲液的连通管，经过一定时间使两侧液面达到平衡后，取下连通管。

在电泳槽的两侧液槽内侧的支持板上分别用四层滤纸（或纱布）搭桥。即使其一端搭到支持板上，另一端浸入缓冲液中。

在醋酸纤维薄膜的无光泽面距一端1．5cm处，用铅笔画一线（与此端平行），作为点样线。把膜放进缓冲液中浸泡数小时，使膜完全浸透。

2．点样　用点样器均匀蘸取血清后，垂直将血清点在薄膜的点样线上，使血清全部渗入膜内。

3．电泳　将点样后的膜条置于电泳槽架上。放置时点样面向下，点样端置于阴极侧。槽架上4层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，膜条要拉展。约平衡5min后通电。电压为6V／cm长（指膜条与缓种液面以上的滤纸桥总长度），电流为0．4～0．8mA／cm宽，夏季通电约45min，冬季通电约1h。关闭电源。

4．染色与漂洗　通电毕，用无齿小镊子将薄膜取出并水平移于染色液中固定染色，2～5min后取出立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景无色为止。用滤纸吸干多余的漂洗液。此时可见界限清晰的5条区带（氨基黑染色为蓝黑色区带，丽春红染色为红色区带）。最前面的一条为清蛋白带。如图13－1所示。

5．定量分析　取试管6支，编号，分别用吸量管吸取0．4mol／L NaOH　4ml。剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条带分别浸于上述试管内，不时摇动，使颜色洗出。约半小时后用分光光度计进行比色。氨基黑10B染色者，选用620nm波长，丽春红染色者选580nm波长。用空白管调零，分别读取各管光吸收值。以各管光吸收值之和作为100%，求出每管光吸收值占总光吸收值的百分数，即为该种蛋白质占血清总蛋白的百分含量。

另外，如用光密度计扫描，需要先使薄膜透明化。可把染色后干燥的薄膜放透明液中10～20min，取出贴到玻璃板上放干，得到透明薄膜，可用光密度扫描计描记出电泳曲线。亦可据此算出各蛋白百分数。

附注：血清蛋白的等电点、分子量及正常血清中各种蛋白的百分数如附表4。

附表4　血清蛋白质的等电点、分子量及百分含量

【注意事项】

1．点样线要细窄、均匀、集中，量不宜过多，保持薄膜清洁。

2．盐桥及醋酸纤维薄膜要放置平整，保证电场均匀。

3．严格控制好电流、电压与电泳时间。电压高，电流强度大，则电泳快，电泳时间虽可缩短，但其产热多，薄膜上水分蒸发也多，严重时会使图谱短而不清晰；相反，电流、电压过低，电泳所需时间延长，由于样品的扩散，也不能获得良好的图谱。一般气温低时，可用较大的电流、电压，气温高时，则宜用较低电流、电压。

【临床意义】

血清蛋白电泳结果有一定临床意义。肝硬化清蛋白明显降低，而γ球蛋白可增高2～3倍。肾病综合征和慢性肾小球肾炎时可见到清蛋白降低，α2和β球蛋白增高。从电泳谱上亦可查出某些异常，例如多发性骨髓瘤病人血清，有时在β和γ球蛋白之间出现巨球蛋白。原发性肝癌病人血清在清蛋白与α1球蛋白之间可见到甲胎蛋白。

（杨江苏）