培养角膜缘干细胞移植的研究

目前，有不少学者应用培养的角膜缘上皮移植进行研究，在动物实验方面取得了一些进展，在临床上开始应用。

1993年Lindberg报道了他的实验结果：他从人眼上取1mm×1mm大小的角膜上皮，用组织培养法，获得角膜上皮细胞。然后将其移植于裸鼠背部的皮下，4d后角膜缘上皮细胞形成5～6层，并牢固地黏附于植床上。而且可以用免疫组化方法在其基底膜上检测出Ⅳ和Ⅶ型胶原蛋白和层黏连蛋白，证实与人角膜上皮基底膜相似。

潘志强等（2000）应用培养角膜干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物实验，结果发现：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上生长增殖，移植后角膜上皮完整，基质细胞浸润减轻，新生血管减少，透明度增加，实验结果显示：角膜干细胞羊膜移植术在兔角膜上可以获得成功，其炎症反应较轻，可能与体外培养的角膜干细胞丧失了某些免疫原性有关。

侯光辉、徐锦堂的实验结果证实：新鲜羊膜，去上皮新鲜羊膜及保存羊膜对外周血T淋巴细胞及CD8＋T淋巴细胞表面分子CD69不产生活化表达，进一步支持羊膜无免疫原性或免疫原性极低的论点。

2001年Koizumi等报道，在临床上应用培养的角膜上皮干细胞移植治疗眼表疾病获得成功。取供体角膜缘上皮细胞，以去上皮细胞的羊膜为载体进行培养，4周后在其表面形成4～5层分化良好的上皮细胞，将其移植到不含上皮细胞层的板层角膜植片上，术后全身应用免疫抑制剂，防止排斥反应，共治疗13眼（急、慢性Stevens-Johnson综合征7眼，早、晚期角膜化学烧伤3眼，瘢痕性类天疱疮2眼，药物引起的假性类天疱疮（1眼）。结果：术后48h，培养的角膜上皮存活，角膜表面透明，视力有所改善。术后6个月有3眼出现上皮排斥反应。说明用去上皮的羊膜作载体培养的角膜上皮可能用来治疗严重的角膜缘干细胞不足。

图7-2　体外通过气-液相培养

注：在脱水保存的浅层角膜基质上培养的复层角膜上皮细胞（7d后），已形成3或4层细胞

吴静、徐锦堂应用脱水保存的同种异体角膜基质片作为培养角膜上皮的载体，外源性层粘连蛋白作为人工基底膜，在体外成功地培养出复层角膜上皮组织。其组织结构与正常生理条件下的角膜组织结构相近，组织由多层细胞构成，细胞呈极性排列，即基底部为柱状细胞，其上为翼状细胞最上端为扁平细胞（图7-2）。

电镜下所示细胞超微结构形成良好，培养20d后的上皮细胞、细胞间连接复合体结构清晰，并可见基底膜成分以及清晰的半桥粒结构（图7-3）。

图7-3　细胞基底膜基本形成，并可见清晰的半桥粒结构TEM×13　000

抗Keratin　64单克隆抗体免疫组化染色所示：体外培养角膜上皮细胞表达角膜特异性分化蛋白K64（图7-4）。

图7-4　20d的体外培养角膜上皮细胞，Kertin64免疫组织图像，示上皮为表达K64蛋白细胞

将培养的角膜上皮移植于兔角膜，术后立即荧光素染色为阴性（见彩图7-1）：术后第3天，肉眼可观察到植片周边的上皮细胞开始向周围无细胞区迁移，10d左右移植的角膜上皮完全覆盖角膜表面，术后1个月，移植片透明（见彩图7-2）。

3个月后电镜下所见：同基因角膜上皮移植3个月后，上皮细胞的超微结构良好，如细胞微绒毛，细胞间指状连接，连接复合体，半桥粒以及完整的基底膜结构均清晰可见。

在动物实验上已取得了一些成果，在临床上也有应用的报道，但有些问题还需进一步解决，例如培养上皮的载体，术后的排斥反应，角膜缘干细胞的来源，以及培养角膜上皮的移植技术，还有待进一步完善。

（徐锦堂　吴　静　陈　剑　侯光辉）