干细胞移植与毛细胞再生

自从1998年人类胚胎干细胞系建立以来，干细胞移植就成为目前研究的热点。干细胞是指来自胚胎、胎儿或体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生机体组织、器官的已特化的细胞，同时，还能分化为组细胞。干细胞根据其发生来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞；根据其分化潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞在发育成熟的过程中，可以获取周围环境的信息，分化成不同的组织特异性表型，所以，在修复疾病所致的组织缺损方面，干细胞有着治疗应用的潜力。

干细胞植入疗法是向受体组织植入干细胞或激活内源性干细胞以修复或替代受损或退行性的受体组织，主要用于治疗病灶比较局限的神经变性疾病，可部分重建和恢复受体组织的结构和功能。干细胞植入疗法具体方法有：分离干细胞，体外诱导增殖和初步分化后植入受体组织；以及用生长因子在原位激活诱导干细胞使其增殖分化。哺乳动物内耳毛细胞缺乏或低再生能力与内耳的干细胞数量少可能有关，通过干细胞称植也许可以解决这个问题。选择移植的干细胞是一个关键问题，目前可供选择的干细胞有胚胎干细胞（embryo stem　cells，ESCs），成体干细胞中的神经干细胞（neural stem　cells，NSCs），内耳干细胞（inner ear　stem cells，IESCs），骨髓基质干细胞（marrow stem　cells，MSCs），造血干细胞等。

（一）胚胎干细胞移植

胚胎干细胞来源于胚胎早期一囊胚（受精后的5～7d）中的内细胞群。内细胞群在形成内、中、外3个胚层时开始分化，其中外胚层分化为皮肤、眼睛和神经系统。ESCs是多潜能性干细胞，具有分化成任何类型细胞的潜力，如果能够被整合进入毛细胞体系，对于毛细胞功能的恢复，具有很大的优势。未分化的胚胎干细胞移植进入内耳显示它不能分化为毛细胞的表型，这提示在将胚胎干细胞移植入内耳前必须进行适当的处理，以使它能够产生毛细胞表现型。可以使用细胞因子如TGF－α、IGF－1、EGF及维A酸（retinoic acid，RA）等诱导培养增殖分化及使用免疫抑制药或自体干细胞以增强干细胞的表达，避免移植排斥反应。具体解决方法有：①利用基因工程方法改变其主要组织兼容性抗原表达；②通过耳器官培养或细胞核转移等方法形成针对内耳毛细胞适用的细胞系。内耳毛细胞起源于外胚层，外胚层细胞的分化演变模式已经建立。因此，通过合适的操纵［如对胚体维A酸（RA）处理等方法］将胚胎干细胞演变分化成毛细胞表现型也是可能的。有报道称小鼠胚胎干细胞体外诱导培养后，成为潜在的内耳前体细胞，将前体细胞移植入鸡胚听泡中，植入的细胞很快结合入发育中的听泡上皮，几天后位于耳蜗毛细胞层，并发育成表达成熟毛细胞标记物的毛细胞样细胞。对于螺旋神经节的功能恢复，胚胎干细胞和神经干细胞一样具有可供选择性。

（二）神经干细胞内耳植入

神经干细胞是成体干细胞中的一种，已进行了首例在听觉系统方面的神经干细胞移植动物实验，以证实恢复听觉传导路径的可行性。大鼠脑组织被移植进入内耳腹侧骨蜗管的一个区域后，它可引起组织再生及相关的功能恢复。Ito等将大鼠海马来源的NSCs移植入新生大鼠内耳后4周，部分存活的NSCs迁移至耳蜗毛细胞表面，形态上与内、外毛细胞相似，并表达毛细胞的标记物Phalloidin，结果显示来源于移植神经干细胞的新生毛细胞在耳蜗内已存活，并且在听觉上皮细胞中夹杂一部分移植进来的细胞。神经干细胞植入疗法具有以下优点：①与宿主细胞有良好的整合能力，且低免疫原性，以用可自我更新和多潜能分化；②神经干细胞可在体外根据不同的需要导入相应的外源基因，成为一种光谱的细胞载体；③极强的迁移能力，容易移植并能够在耳蜗中移植存活。最近有相当的关于神经干细胞在耳毒性损害后移植入内耳感觉上皮的报道。Tateya等报道移植入新霉素损伤成年小鼠耳蜗的NSCs可经分隔内外淋巴系统的隔膜移植入内淋巴区，分布在膜迷路、感觉上皮、螺旋缘等部位。植入的NSCs能够迁移的原因可能是耳毒性药物引起的感觉上皮表面屏障破坏及基底膜损伤。尤其令人鼓舞的是，这些研究表明迁移至前庭壶腹嵴及椭圆囊斑表面的部分NSCs转化为毛细胞，替代了丢失毛细胞的位置，显示神经干细胞具有在体内转化为毛细胞的能力。然而，移植进来的干细胞产生毛细胞的阳性率很小，且在Corti器没有发现相似的情况，而且在听觉功能恢复中很重要的突触联系的形成，在移植进来的细胞中也显示不明。

渐进性的螺旋神经节细胞的缺失是老年性耳聋的主要病因。在Corti器中的毛细胞可提供多种营养因子以维持螺旋神经节细胞的存活，因此毛细胞的死亡往往进一步引起螺旋神经节细胞的退变和死亡，它对于人工耳蜗植入的疗效带来严重的影响。因此，保护和恢复螺旋神经节细胞的功能是干细胞疗法的主要目标。Iguchi等通过移植神经干细胞进入损伤的小鼠内耳等实验证实神经干细胞具有分化为耳蜗管内神经细胞的能力。Tamura等已进行了评估神经干细胞在提高相应的有已知耳蜗神经定位的区域内的耳蜗蜗轴内的神经细胞分化能力的研究，结果显示植入蜗管内的神经干细胞分化成为神经细胞。然而，还不能证实神经干细胞植入是否能转变为螺旋神经节细胞，但是，神经干细胞移植能够通过导入神经营养因子而用于保护螺旋神经节的功能。Miller等通过动物实验证实有几种神经营养因子有保护螺旋神经节的功能，其中胶质细胞源性神经营养因子（glia cell　line derived　neurotrophic factor，GDNF）和神经营养因子－3（neurotrophy factor－3，NT－3）的mRNA表达于新生大鼠耳蜗内的外毛细胞和成年大鼠的内毛细胞，其受体GDNF和trkC（属于酪氨酸激酶原癌基因家族，排位为C）表达于新生和成年大鼠的耳蜗螺旋神经节等内耳组织。陈谦等利用腺病毒介导的NT－3基因在噪声引起的豚鼠耳聋模型上进行实验，结果表明其长期表达于内耳中，并在噪声引起毛细胞死亡后，有效地抑制了螺旋神经节的退变；还有研究表明，对新霉素致聋的大鼠（Corti器破坏）应用含BDNF的因子转染后4周，仍有94．7%的听神经元存活。大部分移植内耳的神经干细胞分化为神经胶质细胞，定位地表达神经营养因子的作用，这一结果显示神经干细胞植入能够局部应用将神经营养因子导入内耳从而起到保护作用。

（三）成体内耳干细胞移植

具有多向分化潜能的人成体干细胞存在于许多组织中，如肌肉、软骨、骨、神经系统以及肝脏和胰腺中。最近Li等已成功从内耳中分离并增殖出内耳干细胞，它位于椭圆囊感觉上皮内，也具有多向分化潜能。这些干细胞在体内具有分化成毛细胞、支持细胞及其他神经细胞表现型的能力，而且它们在体外和体内都具有迁徙入听神经或前庭神经感觉上皮的能力。应用耳器官培养系统降低免疫排斥反应的方法以证实内耳干细胞移植可行性的研究同样也已开展。Fujino等从小鼠胚胎的内耳中分离并培养出类似的内耳干细胞。Malgrange等也从胚胎后期及新生大鼠耳蜗中发现了干细胞，在体外培养该细胞，可出现经有丝分裂活动后呈一定分化状态的细胞群，并推测该细胞有可能成为耳蜗损伤后再生新的毛细胞和支持细胞的来源细胞。Ryan等通过将毛细胞前体细胞、毛细胞和内耳干细胞分别在体外和体内分离移植培养进行实验，这些研究试图阐明内耳干细胞迁徙如听觉或前庭感觉上皮的机制。在诱导毛细胞的再生从而修复受损的耳蜗，进行感音性聋的治疗方面，利用耳蜗来源的干细胞显然比其他神经系统来源的干细胞更为合理。在体外定向分化为毛细胞标志物阳性细胞的潜能方面，内耳干细胞与神经干细胞比较有很大优势。首先，内耳干细胞分化表达毛细胞标志物阳性细胞的概率在10%左右，而神经干细胞只有0．1%；其次，在比较形成静纤毛束结构等方面，内耳干细胞似乎更容易完全分化为毛细胞。因此，利用成体内耳干细胞移植也许是将来干细胞移植治疗感音性聋的主要方向。

（四）骨髓基质干细胞移植

从临床应用干细胞疗法治疗感音性聋移植的方便性及可操作性这一关键方面考虑，骨髓基质干细胞（MSCs）具有很大的优势。MSCs是成体干细胞的一种，具有干细胞的共性。一般认为MSCs存在骨髓中，但最近研究发现从人骨骼肌中也分离出了MSCs。MSCs起源于中胚层，地塞米松是MSCs分化的非特异诱导剂，它可使MSCs分化为肌细胞。自身来源的MSCs可以在个体自己的骨髓中轻易得到，没有免疫排斥反应和组织配型问题，且不影响机体健康。而且，近来Jiang等研究表明MSCs不仅能够产生成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞，而且也能产生神经细胞。因此，MSCs也许可以用来移植以恢复毛细胞及螺旋神经节的功能。使用MSCs进行这样的治疗，显然会降低，甚至避免使用来源于人体胚胎的干细胞，这些来源往往会给人们带来伦理上的麻烦。最近Naito等通过将自身来源的MSCs移植入栗鼠耳蜗的实验证实自身来源的MSCs移植入耳蜗能够存活。MSCs在耳蜗的神经分化也已被报道。同时，通过MSCs转染移植以获得合适治疗感音性聋的物质，包括神经营养因子也是可能的。这些发现显示运用MSCs移植以保护内耳组织治疗感音性聋的可行性。

（五）造血干细胞移植

Parker等报道，造血干细胞也可作为一种可用的生物学工具用于内耳耳蜗的功能修复。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的基本特征是具有自我维持和自我更新。由于生理需要，造血干细胞始终处于较为活跃的增殖与分化状态，能从骨髓源源不断地进入外周血而到达全身各处，而成熟个体中的多能干细胞多局限于相应的组织器官中，一般情况下处于类似休眠的状态；同时，造血干细胞具有可塑性，可以分化为肝脏、肌肉及神经等组织的细胞，一定条件下又可来源于肌肉干细胞、神经干细胞等。因此推想造血干细胞也有可能被用于移植而分化为毛细胞，从而治疗感音性聋修复内耳生理功能。

总之，近来关于将干细胞移植入内耳方面的研究已显示运用这种方法恢复和保护毛细胞及其相关神经细胞的可行性。然而，尚需解决下列移植关键问题：①选择适合的干细胞来源及它们的可行性；②干细胞分离和体外培养扩增的有效方法及如何提高植入细胞的存活率；③增强干细胞表达，避免移植排斥反应；④搞清干细胞分化机制，为干细胞定向诱导分化为内耳毛细胞创造最佳条件等。众多可供选择的移植干细胞无疑会为感音性聋的治疗和生理功能的恢复带来美好的前景。