外周血造血干细胞移植

（一）外周血干细胞的采集

1．采集方法　外周血干细胞（PBSC）的采集方法与成分血的单采术类似，即用血细胞分离机分离外周血的单个核细胞组分，多采用淋巴细胞分离的程序进行分离。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺困难（尤其是小儿）时需中心静脉穿刺。成年人采集时的血流速度为50～60ml／min，每次分离4～6循环（3～4h），分离血液的总容积9L，依据情况连续或隔日采集。儿童采集时的血流速度和分离的总容积应依年龄和体重而定。

（1）血细胞分离器（BCS）是分离单个核细胞必用的器械，通过离心作用使细胞分层，并分别放于旋转的容器里（计或不计流量）可连续或间歇收集。通常情况下，在3～4h的采集过程可处理正常血容量的2～3倍的血液容量（10～12L）。因为绝大多数细胞分离器都有相当大的无效腔，在较小的儿童（15～20kg）行PBSC采集时，需准备红细胞以补充无效腔中的丢失。如果要采集大量的白细胞，常需用20～25L的血容量（血液加上抗凝剂）。由于儿童的全身血容量（TBV）较低，为避免细胞分离机初始化进行时血容量骤降，对TBV＞2L的儿童（约相当于体重＞20kg，年龄6岁左右）初始化用盐水处理；TBV＜2L的小儿（体重8．5～20kg，年龄10～76个月），则联合用清蛋白、经照射和洗涤的压积红细胞以及0．9%NaCl液以充盈分离器处理。

（2）静脉导管或静脉穿刺的应用：在用BCS进行外周血（含造血干细胞的白细胞混合液）分离时，每分钟达60～80ml的血流量，因而找到足够供给此血流量的静脉或导管是很必要的。儿童进行外周血移植时应注意点：导管的放置是必需的，导管应是儿童专用的（长度为28～36cm）。2岁以下的儿童可用18cm长的导管，插管的部位常选择锁骨下静脉或股静脉，儿童的全身血量75ml／kg体重，如体外血量＞10%～15%的全身血量时，应进行血量的补充，可用经照射后的红细胞、5%的清蛋白以扩充血容量，维持血压，对特别小的儿童其血液回输管道应该加温以保持体温。

（3）抗凝剂的应用：在进行白细胞分离时，抗凝剂是不可少的，部分血液在体外BCS中运转，必须用抗凝剂进行抗凝，常用者为AC－A溶液，其配方为1L溶液中含枸橼酸钠22g，枸橼酸7．3g，每11ml全血中混入1ml的ADC－A液，ACDA全血流速（WBFR）的比率为1∶11～1∶15，特别小的小儿可以先用肝素50U／kg（1次输入），以后20U／（kg·h），这样可使ACD－A／WBFR之比下降到1∶20～1∶26以减少枸橼酸的输入量。采集中抗凝方法：TBV＞2L的儿童用ACD－A，TBV＜2L者采用ACD－A联合肝素以防低血钙。不同年龄供者采集PBSC的血流速度为＜2岁：20～30ml／min；2－5岁：20～40ml／min；＞5岁：40～60ml／min。

2．采集时机的选择　动员后检测外周血干（祖）细胞峰值时间，对选择采集时机有指导意义。但目前尚无体外检测多能干细胞的方法，琼脂半固体Cgu－GM集落培养需要14d才能知道结果，而且实验结果很难重复，也不能作为确定采集时机的指标。国内外常用选择采集时机的参数为：

（1）血细胞计数：在白细胞数从最低点回升至1×109／L，为开始采集的时机。国内多个单位的临床体会为白细胞数在（4．0～5．0）×109／L，单核细胞比例＞10%～30%时为最佳采集时机。当白细胞计数迅速上升时可每天进行连续分离，对那些白细胞数需超过5d才能从1×109／L上升至31×109／L的患者，要放弃分离细胞，因为分离出来的细胞不可能出现高水平CFU－GM。若单用G－CSF动员宜在白细胞计数升至（5．5～10．0）×109／L、血小板计数≥50×109／L时进行采集。

（2）CD34＋细胞：CD34＋的早期造血细胞不携带淋巴细胞、成熟的髓系细胞和单核细胞的标志物，其含量与CFU－GM呈线性相关。由于CD34＋细胞及其亚群细胞能被流式细胞仪精确测量，2h内得到结果，可以及时反映外周血造血干（祖）细胞峰值，所以是决定收集干细胞的时间和评价PBSC的造血重建能力的快速可靠的检测方法。多数供者外周血干（祖）细胞的峰值出现在GCSF用药后6～8d，故有流式细胞仪的医疗单位，可在动员后第5天开始每天检测外周血CD34＋细胞，在其峰值时间进行采集。大多数移植单位选用外周血CD34＋细胞＞1%，或外周血CD34＋细胞峰值位于（20～40）×106／L时作为开始采集的指标。

3．采集外周血造血干细胞的时间及数量　Allo－PBSCT采集PBSC的时机较为重要，对Allo－PBSCT的外周血造血干细胞的动员、采集、输往应与受者同步进行，健康供者用G－CSF动员时，虽在4～6h即可见白细胞增多，但血中CD34＋细胞只有在3d后才持续增加，在用G－CSF　5～6d达峰值，其后即使继续用G－CSF，血中CD34＋细胞数量逐渐下降，故采集时间应在动员后5～6d，以上午9时左右开始为宜。高体重供者、低体重受者的PBSCT常只需采集1次即可；低体重供者、高体重受者可能需采集2～4次才能达到所需细胞数阈值。为避免血中白细胞过高可能引起的不良反应，在白细胞＞70×109／L时，应减少G－CSF剂量。

4．采集的质量指标及注意事项　目前多数人主张用CD34＋细胞数作为采集PBSC时的质量控制指标。也有学者认为，用处于DNA合成期的MNC数作为PBSC的质量指标，它比用CD34＋细胞更快捷更稳定。PBSCT植活所需HSC量远超过BMT所需的骨髓细胞量，根据多数学者的报道，Allo－PBSCT的剂量值（阈值）：MNC＞（5～8）×108／kg，CFU－GM＞（20～50）× 104／kg，CD34＋细胞＞（2．0～5．0）×106／kg。

PBSC采集过程应注意：①正确选择分离程序；②良好的血管通路，保证足够的血流速度；③适当的ACD－A抗凝剂量，过多易致ACD反应，过少易致产品凝集；④观察供体反应：恶心、头晕或口周、手足麻木等，应及时处理；⑤采集中可予饮料或糖水以防被采集者饥饿或低血糖；⑥血红蛋白及血小板减少，处理：一般不输血小板，所有输注的血制品必须予15～25Gy照射；⑦困乏、发热、头痛、腰背痛，处理：对症处理，持续发热经抗感染治疗后不退热时则不采集；⑧恶心、呕吐，此为血管反应，处理上给予吸氧，减慢血流流速，症状可缓解。

（二）Allo－PBSCT在儿童白血病中的应用

1．Allo－PBSCT治疗儿童白血病的现状　由于观念上的误解和捐献骨髓时所需的麻醉及局部疼痛，在我国相当一段时间内血缘相关和非血缘相关骨髓的来源将受到极大的限制。而且，同胞间HLA全相合比例仅为25%，整个家族中家庭成员HLA相合的供者也仅为36%。加之我国的家庭日趋小型化，有机会接受HLA全相合血缘相关移植的儿童白血病患儿明显减少。随着GCSF的使用，近20年来Allo－PBSCT的发展迅速，该方法易为供体接受，同胞或非亲属供体多愿提供PBSC，Allo－PBSCT已成为儿童白血病治疗的有效方法之一。一般来说，一切需行异基因骨髓移植（Allo－BMT）的疾病治疗均可采用Allo－PBSCT来替代，但因PBSCT的慢性移植物抗宿主病可能比BMT严重，故选择病种时应有所侧重。白血病由于骨髓受累者，选择PBSCT产生良好移植物抗宿主病的同时，也产生移植物抗白血病效应，可使移植后白血病复发机会明显减少。

目前对于应用Allo－PBSCT治疗儿童白血病的大宗病例报道较少见，已有研究表明成年人HLA相合的非血缘相关Allo－PBSCT与Allo－BMT效果相当。由于Allo－PBSCT后造血及免疫功能的重建快于常规Allo－BMT，因此Allo－PBSCT后因骨髓衰竭和免疫缺陷所致的移植相关死亡（TRD）可能低于Allo－BMT，Allo－PBSCT后的早期生存率优于Allo－BMT。Bensinger等的一组回顾性分析报道，PBSCT后200d的TRD可能性为27%，远低于BMT组的45%。还有资料显示，PBSCT后的早期与预处理相关的毒性也低于BMT。Champlin等对IBMTR7EBMTR登记的PBSCT和BMT治疗急性白血病的分析结果显示，PBSCT组1年的累积TRD为28%，低于BMT组的33%。不过由于Allo－PBSCT后移植物抗宿主病尤其是广泛慢性移植物抗宿主病发生率及由此导致的并发症和相关死亡高于Allo－BMT，多数临床资料结果表明Allo－PBSCT的总体生存率和无病生存率与Allo－BMT效果相当。但同样在IBMTR／EBMTR登记的资料中发现，应用Allo－PBSCT治疗儿童急性白血病的TRD反而高于BMT，说明Allo－PBSCT在儿童与成年人的疗效可能有不同，还有待进一步研究。

2．发展前景与展望　Allo－PBSCT有许多优点，如采集造血干细胞较简便、不需要住院、不需麻醉、患者或健康供者易于接受、合并症少、短期内可重复分离等。动物实验和临床试验结果均表明，Allo－PBSCT短期造血免疫重建比Allo－BMT快，植入率高，且有较强的移植物抗白血病效应，目前Allo－PBSCT已成为治疗儿童白血病的有效方法之一。

然而Allo－PBSCT发生慢性GVHD的风险较大，为Allo－BMT的2～3倍，另外，重组细胞因子作为动员剂对供者的安全有待于观察。今后Allo－PBSCT的发展趋势：①细胞因子和化疗方案进一步优化组合，减少细胞分离的次数和过程，并发展正常细胞和肿瘤细胞的不同动员方案；②提高PBSC的采集技术，直接选择CD34＋细胞，以减少T细胞，降低慢性GVHD的发生。如果Allo－PBSCT的主要生物学问题，即GVHD、复发、植入失败等能够通过体外处理PBSC得以克服的话，那么HLA半相合供者也可考虑作为捐献造血干细胞的供者。如此，对于几乎每一个需要造血干细胞移植的患者来说，均可得到合适的造血干细胞进行移植。随着未来造血干细胞动员技术的提高，如使用联合细胞因子和（或）对抗黏附分子的单抗，可以从仅仅500ml外周血中就可以采集到足够的祖细胞，从而可以省略了白细胞分选过程，Allo－PBSCT将在未来临床应用中发挥更为重要的作用。