昆虫的基因组和蛋白质组学

基因组学（genomics）是一门研究基因组（genome）结构和功能的科学，是描述每一个基因在特定的发育阶段或在特定的生理条件下的表达状况。一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类蛋白质称为蛋白质组（proteome）。蛋白质组学（proteomics）在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律，除了阐明昆虫细胞图谱和昆虫蛋白质的功能，最重要的是可能为其药物治疗研究提供新的靶标和疫苗候选分子。一个有机体只有一个确定的基因组，但是它们的表达产物蛋白质组却是一个动态的概念，在不同细胞、不同发育阶段、不同生理状况、不同外界环境下都不相同。

（一）基因组学

1．基因组学研究内容　基因组学是对生物体整个基因组结构、功能及其进化的研究，也即对生物体内由细胞核和细胞器DNA所编码的整套遗传信息的研究。基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics）。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，主要是指运用遗传学、分子生物学方法为各种生物绘制完整的基因组图谱和测定其基因组序列。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。

2．基因组学研究技术　主要包括：①核酸测序（微量化技术、高通量DNA测序仪法、单核苷酸测序法等）；②分析基因表达技术：用于研究基因功能及其表达模式的基因芯片（DNA微点阵技术）、寡核苷酸芯片技术等。

目前昆虫基因组的研究主要集中在模式昆虫黑腹果蝇。黑腹果蝇的基因组在2000年被破译、2002年按蚊基因组测序完成及2004年蜜蜂的基因组测序的完成都有着重大的意义。

基因组学技术目前在医学昆虫中应用广泛。

夏平安等（2003）从孵化36h的蝇蛆中提取基因组DNA，用限制性内切酶Bcl I随机酶切，回收10～23kb的酶切DNA片段，通过匹配黏性末端与磷酸化的EMBL3BamH I酶切载体臂连接，在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体，成功地构建了家蝇基因组文库。并重组噬菌体转染KW251宿主菌，测定文库效价为5×104pfu／ml。

郝宏兴等（2003）分离大劣按蚊成蚊mRNA，用Stratagene公司的ZAP Express文库构建试剂盒成功构建了cDNA文库为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定了基础。

随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，简称RAPD）是一种随机引物扩增，寻找多态DNA片段的遗传标记技术，它是建立在PCR技术基础上，以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物，对基因DNA进行扩增，其引物无特异性，可以用未知序列的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段，且RAPD所需引物较短；其次，一套引物可用于不同生物，建立一套标准引物，便可用于生物种内多态性鉴定。它在医学昆虫中的研究主要集中于双翅目和同翅目。田桢千等（2000）通过RAPD技术获取四川、云南、江苏3个不同地区嗜人按蚊DNA指纹图谱，比较嗜人按蚊不同地区基因组DNA的多态性，从分子水平上对不同分布区嗜人按蚊进行差异分析。结果发现不同地区嗜人按蚊之间的DNA片段在绝大部分相同的情况下存在差异，3个不同地区基本上具有共同的扩增片段，证实了各地理区域基因组DNA的同源性；同时各个地区所特有的片段及条带亮度（扩增片段强度）有差别，结论为嗜人按蚊地理种型的鉴定提供分子水平的分类。

李秀兰等（2003）以淡色库蚊抗性品系全长cDNA文库为模板，采用PCR方法扩增出抗性品系中高表达NYD－Ch（糜蛋白酶）NYD－Tr（胰蛋白酶），经T／A克隆测序鉴定，将扩增产物用NotⅠ、EcoRⅠ双酶切后作插入片段，与具有相同粘性末端的融合表达质粒pET－28a（＋）连接，转化入表达菌株E．coli BL21中，取含重组表达质粒的重组菌株以IPTC进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE电泳和小鼠抗NYD－Ch和NYD－Tr抗血清进行Western blot分析鉴定。成功进行了色库蚊抗药性相关基因NYD－Ch和NYD－Tr表达与鉴定。

另外，可以通过基因组作图，发现抗药性基因并将其定位。并通过比较不同种类昆虫的遗传图谱或物理图谱，可以发现昆虫间的相同抗药性机制，但需要有一定数量的锚定基因座。锚定基因座能够为相关种类昆虫的基因组比较以及遗传结构提供参照位点。

（二）蛋白质组学

1．蛋白质组学研究的主要内容　主要分为结构蛋白质组学（蛋白质氨基酸序列及三维结构的解析、种类分析及数量确定）和功能蛋白质组学。

研究内容如下：①蛋白质细胞（或组织）表达谱：采用双向电泳技术分离蛋白质，再以质谱技术对蛋白质进行鉴定；②蛋白质翻译后修饰：目前研究较多的是磷酸化修饰，常用方法是在双向电泳后，用P32标记或磷酸化丝氨酸等特异性的抗体做western blot印迹检测磷酸化蛋白质，然后以质谱法鉴定蛋白质；③蛋白质功能确定：利用有目的去除基因和反义技术分析基因表达产物－蛋白质的功能；④结构蛋白质组学：确定蛋白质的多级结构，明确结构与功能的关系；⑤蛋白质在胞内分布与定位：一是分别收集各种亚细胞结构内的蛋白质后进行电泳和蛋白质鉴定；二是将细胞内特定蛋白质进行荧光标记后在荧光显微镜下观察蛋白质移位；⑥蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他分子的相互作用：是研究调节细胞反应适度的必要条件的必要内容。

2．蛋白质组学研究技术　蛋白质组分析的三大主要步骤是：①分离复杂的蛋白质混合物；②鉴定分离出的多肽；③数据库比对。与此相对应的三大核心技术分别是双向凝胶电泳（二维凝胶电泳）技术、质谱技术、生物信息学。首先进行凝胶电泳，凝胶上的蛋白质点通过各种不同类型的染色法（如银染法、考马斯亮蓝染色法等）可产生一张蛋白质参考图谱，然后利用分析软件可以对凝胶图像进行比较分析，寻找有生物学意义的蛋白质。

蛋白质组学研究技术主要分为几大类：

（1）蛋白质分离技术：多采用电泳技术。主要是双向凝胶电泳（two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2－D电泳）是最有实用价值的核心方法之一。电泳第一相为等电聚焦，根据蛋白质的等电点不同而分离；电泳第二相为SDS－PAGE，是根据蛋白质相对分子质量的差异来进一步分离蛋白质混合物。可同时用于蛋白质的分离和纯化。

差异凝胶电泳（difference gel electrophoresis，DIGE），是双向电泳技术的新发展。通过在电泳前用不同的荧光染料花青（cyanine），如Cy2、Cy3或Cy5标记要比较的样品，再将差异标记的样品混合后在同一块胶上进行电泳，然后用不同的波长分别来检测荧光，从而实现在同一块凝胶上表现不同样品的差异。

另外带有核素的亲和性标签标记法以及毛细管区带电泳等等也可作为补充。“双向”离效柱层析可分离到较多的蛋白量且可与质谱分析联用，使分离流出的蛋白峰直接进入质谱仪进行鉴定。

（2）蛋白质鉴定技术：主要是生物质谱技术，它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类，是样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定分子量。

液相色谱质谱联用的多维蛋白鉴定技术（multi－dimensional protein identification technology，MUDPIT）是一种应用较广的质谱技术，方法是先将蛋白质混合物进行酶切（可以用一种酶切或几种酶同时切）得到混合肽段，然后通过强离子交换反相色谱柱进行多次分离并连用LCMs／MS分析肽段，并且通过核素标记肽段的技术来实现蛋白定量分析。

（3）蛋白质组数据库：计算机图像分析与蛋白质组数据。

生物信息学（bioinformatics）是使用计算机技术储存和分析生物学信息，由此建立的基因组数据库加速了分子生物学的进展。蛋白质组数据库将是生物信息学的新领域。

（4）蛋白质间相互作用研究技术：主要采用酵母双杂交系统。

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报道基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

蛋白质组技术已经用于医学昆虫的研究。

Paskewitz SM等（2005）采用双向电泳、微序列测定及肽指纹图谱鉴定了冈比亚按蚊的血淋巴的蛋白质组。

杨松等（2004）在用2－DE和PMF分离和鉴定约氏疟原虫卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋白的研究中，采用固相pH梯度二维电泳分离中肠和血淋巴差异表达蛋白，考马斯亮蓝染色，Image Master VDS－CL凝胶扫描和PDQuest2DElite软件分析，差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用Peptldent软件查SWISS－PROT数据库。获得了分辨率和重复性均较好的2－DE考马斯亮蓝图谱，吸硝喹糖水组蚊血淋巴和中肠蛋白点分别有101个和104个，感染组分别有115个和162个，匹配点分别为51个和44个。研究表明斯氏按蚊血淋巴和中肠蛋白质组中蛋白点分别主要分布于酸性端和碱性端，血淋巴和中肠差异蛋白也分别主要分布于酸性端和碱性端。随机取25个差异蛋白点进行胶内原位酶解－肽质指纹图谱分析得到了l6个蛋白质肽质指纹图，查询数据库初步鉴定了8个蛋白质，分别为与抗疟免疫、黑化、结构、糖代谢、细胞通讯等相关蛋白。

（田　晔）