蛋白质组学实验技术

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组学研究的三大基本支撑技术。

（一）双向电泳技术

双向电泳技术，即二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术（图6-11）。Smithies和Poulik最早引入的二维电泳技术，他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质，随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等点聚焦技术在一向的应用使基于蛋白质电荷属性的分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是由O’Farrell和Klose于1975年分别提出的。其原理是蛋白质首先根据等电点的不同，在等点聚焦电泳中分离，接着被转移到SDS-PAGE，再根据相对分子质量大小不同分离。

图6-11　双向电泳

用于二维电泳分离蛋白质的常规检测和定量的普遍方法是考马斯亮蓝染色和银染，但测序技术和质谱灵敏度的提高，尤其是Q-TOP类液相色谱串联质谱技术的发展，大大提高了质谱鉴定的灵敏度，从而使蛋白质显色的地位从简单的蛋白质点呈现转换为集成化的蛋白质微量化学表征工程中的关键步骤。随着高灵敏度蛋白质分析方法和电泳后鉴定技术的结合，考马斯亮蓝染色和银染用于蛋白质组研究的局限性日益暴露出来。新的染色技术如荧光标记、同位素标记技术在提高了灵敏度的同时，也与自动化的蛋白质组平台切胶技术相兼容，染色技术向高灵敏度和自动化方向发展。由于不同染色方法对仪器设备的要求不同，在实验中要综合考虑各种因素，以选择最佳方案。

二维电泳虽然仍是蛋白质组研究不可替代的分离方法，但有些问题依然是该技术所无法解决的，主要存在于以下几个方面：①低丰度蛋白的检测，有许多细胞因子及功能蛋白质往往表达量很低，用目前的显色方法难以呈现，而且按目前检测到的蛋白质点数，不可能全部包括细胞内所表达的上万个甚至更多的蛋白质，那么，剩下的那部分蛋白如何检测；②极酸和极碱性区蛋白的分离，目前商业化的胶条分离极酸和极碱性区蛋白难度依然很大；③高分子质量蛋白的分离，由于IPG胶条在重泡涨时，分子质量大于10ku的蛋白质很难进入胶条，这部分蛋白质也很难在二维电泳胶上呈现出来；④膜蛋白的提取和有效分离，无论是动物细胞、组织、酵母、细菌和植物，膜蛋白很难出现在二维电泳凝胶图谱中，原因是：膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等点聚焦的水相介质中的蛋白；⑤需要一种真正高通量的胶上蛋白呈现技术。这些蛋白质的呈现问题称为蛋白质研究的“瓶颈”。不过近年来一些新研究也在致力于改善这种状态（图6-12）。

图6-12　ATRA诱导HL-60细胞凋亡启动时的蛋白二维凝胶电泳（银染扫描图）

100μg HL-60全细胞裂解蛋白，利用分析型二维电泳，在pH3～10的范围内进行等电聚焦和14%聚丙烯酰胺凝胶浓度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染的凝胶经图像分析

（二）计算机图像分析与细胞蛋白谱的建立

获得蛋白质双向电泳凝胶后，要对凝胶图像进行备份保存，以数字化图像的形式存储下来，而且要尽量完整地保留定性定量信息，以利于进一步的分析。通过对批量双向凝胶图谱的分析，应该获得的信息包括每一块凝胶中所分离得到的总蛋白质点数、双向电泳凝胶之间的批次重现性、蛋白质点的缺失和出现以及多块胶之间蛋白质点的表达丰度的定量变化，而这些工作仅仅依靠眼睛的分辨能力来执行是不现实的，很难系统全面地对整个凝胶图像进行判断，更不用说要对蛋白质点的表达量进行比较分析。要对上千个蛋白质点进行分析，只有依赖于双向电泳分析软件对双向电泳图谱进行分析（图6-13）。

图6-13　图像处理前后凝胶对比

A．人巨细胞双向电泳图谱，垂直SDS-PAGE（14%连续胶）；B．经PDQuest软件背景削减和高斯拟合处理后的图谱

双向电泳图谱分析一般包括以下几个步骤：图像采集、图像加工、点的检测和定量，凝胶匹配、数据分析、数据解释和构建数据库。图像采集是通过扫描仪或数码相机将凝胶转换为数字图像，其参数设置对于以后的蛋白质点的内在信息抽提是比较重要的，因为以后的整个图像加工过程实质上是给图谱上的每个蛋白质点进行精确的定位和定量（以面积和密度作为指标）。图像加工主要是指软件通过一定的算法来去除图谱上非蛋白质点的杂质和染色不同造成的不同深浅的背景。点的检测主要是产生每个点的X、Y轴坐标，外形参数和密度参数，并对每个蛋白质点做数字模拟合成。对于点的检测和定量，目前采用的算法可分为高斯拟合（Gaussian fitting）和拉普拉斯算子高斯拟合（Laplacian of Gaussian）两大类。除了在单块胶上获得点的信息外，在一系列不同胶上监测某个蛋白质点的变化是生物学分析所感兴趣的问题。不同图像间的比较首先要确定足够的坐标，即每块胶上都存在的点。这些坐标用于确定图像间几何转换的多项式，然后用于其他点的匹配。表达量变化的蛋白质点或已经鉴定的点可在软件中进行数据归类和解释，还可以建立数据库通过因特网来进行成果共享。

（三）生物质谱技术与蛋白质鉴定

在蛋白质组学研究流程中，蛋白质鉴定是最关键的一环。蛋白质组学研究与传统的蛋白质研究最重要的区别在于前者是大规模研究，因此在研究策略上必然是从整体出发的大视野，但落实到蛋白质组中的单个蛋白质成分的研究技术，并没有脱离蛋白质研究的基本框架。可以认为，蛋白质组学大规模技术的发展必然促进对单个蛋白质的研究，而很多在单个蛋白质研究中得以应用的技术很快应用到了蛋白质组学研究中。蛋白质鉴定中依据的参数主要有分子量、等电点、序列、氨基酸组成和肽质量指纹谱等。进行高效鉴定的方法是质谱法。质谱法基本原理前已述及，质谱法在蛋白质鉴定中的应用主要有如下几个方面。

1．质谱法分析完整蛋白质和多肽 对完整蛋白质或多肽分子质量的确定，是蛋白质结构分析的重要部分。对于点突变的蛋白质、不均一的糖蛋白、多位点修饰的磷酸化蛋白质、N端封闭或残基被共价修饰的蛋白质而言，质谱法是快速准确的鉴定方法。

2．质谱法分析蛋白质一级结构 蛋白质测序法是分析蛋白质和多肽一级结构的传统方法。但蛋白质测序法只能鉴定末端（N端或C端），要获得蛋白质所有氨基酸序列，还需将蛋白质进行酶解，酶解肽段经色谱分离收集后，分别测序，再拼接成全序列。二质谱法可以一次分析蛋白质酶解的所有肽段，解析序列，从而获得蛋白质完整的一级机构。而对于分子质量较小的多肽，只需根据分子质量和MS／MS数据，即可分析其一级结构。采用质谱法分析蛋白质的质量肽谱，获得每一肽段的分子质量和序列后，即可对蛋白质进行鉴定。这个方法可用于验证由cDNA推出的蛋白质序列，而且特别适用于鉴定基因工程重组蛋白质是否与预期的序列符合，是否均一，突变位点是否准确等。

质谱法结合数据库检索可对多肽和蛋白质进行鉴定。其方法：一是肽质量指纹图谱法，这一方法的理论基础是人为每个蛋白质经过酶解称为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质应是专一而特异的，因此称为肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）。这一方法不需对图谱进行人工解析，只需将实验获得的PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定蛋白质。因此，比传统方法速度快、通量高，是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。近年来，随着蛋白质数据库或由基因组数据库和EST库等衍生的蛋白质数据库的快速增长和完善，使PMF方法的适用性大大增强。二是一级质谱（MS）结合串联质谱（MS／MS）技术鉴定蛋白质，由于MS／MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一个肽段的序列。因此，根据一级质谱（MS）测得的精确分子质量和串联质谱（MS／MS）所得的序列信息，通过蛋白质数据库检索，大大增加了蛋白质鉴定的准确性。三是序列标签法鉴定蛋白质，Mann等发展了根据序列标签来搜寻肽段的方法。在MS／MS或PSD对肽段的序列分析中，通常获得的是部分序列，特别是肽链中段的序列，根据肽段的部分序列和序列两端的肽质量，可以对肽段进行鉴定。

蛋白质组学从研究内容到研究技术可以说是日新月异，目前，亚细胞器的蛋白质组学、疾病相关蛋白质组学、新药开发蛋白质组学以及蛋白质组学在微生物、肿瘤、神经系统、体液研究中的应用已进入蓬勃发展时期。蛋白质组学是在蛋白质水平上研究生命现象的工具，随着科学技术的发展以及相关数据库的充实，蛋白质组学会有更广阔的前景，必将对生命科学的研究和现代生物技术的发展作出重大贡献。