生物表面活性剂的生产方式

二、生物表面活性剂的生产方式

生物表面活性剂的发展起始于20世纪70年代后期，当时主要是由微生物发酵的方式生产生物表面活性剂。20世纪80年代中期，随着非水相酶学的开辟和进展，由酶促反应合成生物表面活性剂成为可能。目前微生物发酵和酶促反应已成为生产生物表面活性剂的两条并列途径，生物表面活性剂的概念已扩展到由这两种方式生产的所有生物表面活性剂。

1.微生物发酵生产生物表面活性剂

发酵法生产生物表面活性剂开发较早，进展较快，目前已经阐明了微生物生产低分子量表面活性剂及其前体的机理。发酵法生产可以利用不同条件下的微生物细胞，如细胞生长相关型生物表面活性剂是细胞繁殖生长中的代谢产物;在限制条件下用生长细胞生产生物表面活性剂;用休止细胞生产生物表面活性剂;或是将发酵与生物转换结合起来，通过加入一种底物前体生产生物表面活性剂等(图14-4)。

图14-4　生物表面活性剂的生产方式

(a)生长相关型(b)限制条件下生长相关型(c)休止细胞型

1.底物2.细胞生长3.生物表面活性剂4.限制因素如氮源

发酵法生产生物表面活性剂已有间歇式、半连续式和连续式操作等多种模式，流化床反应器、固定化细胞等已用于中试和生产过程。

许多微生物都能以烃类为唯一碳源产生生物表面活性剂。因此以烃类为基质生产生物表面活性剂是生物表面活性剂生产的主要方式。从目前看来，大多数生产菌需要某种烃类作为生物合成的碳基质。其中酵母菌和真菌主要利用直链饱和烃，细菌则可利用异构烃、环烷烃、不饱和烃和芳香烃。此外，有些微生物(如枯草杆菌)能以水溶性底物为碳源，还有些微生物(如假单胞菌)能同时以烃类和水溶性底物为碳源。在生物表面活性剂生产用培养基中，碳源是生物表面活性剂结构与产量的关键，其他可能影响生物表面活性剂生产的营养成分包括氮源、磷源、金属离子和其他添加剂。此外，反应条件如温度、培养基pH值和溶解氧水平或搅拌速度对生物表面活性剂的生产也具有重要影响。

生物表面活性剂的合成可通过油性物质的诱发作用、葡萄糖等物质的代谢抑制等方法进行调节，改变发酵条件如温度等都可对生物表面活性剂的合成进行调节。研究表明，烃和其他不溶于水的物质可以诱发微生物生产生物表面活性剂。

通过诱变育种和基因工程手段也可以提高生物表面活性剂的产率。诱变育种是筛选高产菌株的常用方法，有时可获得极佳效果，但这类方法的随机性和盲目性较大。基因工程和分子生物学的进展已使改变菌种的底物选择性和提高产率成为现实，例如在Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)细胞中导入E.coli(大肠杆菌)的lac质粒，便能使其具有利用工业废料生产鼠李糖脂的能力。

2.酶促反应生产生物表面活性剂

酶促反应合成生物表面活性剂起步较晚，但进展较快，其主要原因是:①酶法合成的生物表面活性剂比发酵法合成者在结构上更接近化学法合成的生物表面活性剂，因而可以直接应用于化学合成产物原有的应用领域。②通过酶促反应可以对亲油基结构进行修饰，并使之与生物表面活性剂的亲水基结构结合。③发酵法是一种活体内(in vivo)生产方法，条件要求严格，产物较难提取;而酶法是一种离体(in vitro)生产方法，条件相对粗放，反应具有专一性，可在常温和常压下进行，产物易回收。

酶促反应生成表面活性剂起初在水溶液中进行。由于存在大量水，水解反应的热力学和动力学方面都比合成反应有利，因而妨碍了获得高产率生物表面活性剂。20世纪80年代初，人们发现酶在非水介质中有很好的稳定性，酶在有机相中不溶可以阻止其严重失活。而少量水存在可显著改善酶的刚性，使其维持具有催化活性剂的必要构型，非水介质条件不仅有利于浓集反应物质，而且可使水解酶的催化转向，使其维持具有催化活性的必要构型，使化学平衡向热力学不利的产物形成方面偏移，即不是破坏化学键而是促成其合成。这一发现开创了非水酶学的研究领域并使之在生物表面活性剂合成中得到应用。目前，非水溶剂和无溶剂法合成生物表面活性剂已成为酶法合成的主流，并使某些品种如甘油单酯、糖醇酯等获得90%以上的产率。酶法合成生物表面活性剂的最大问题是两种底物的互溶性问题，解决互溶性常用的方法有:①选择合适的非水溶剂可加大两相溶解度，而要获得足够的动力学趋势和达到高产率并不需要两相完全混合。②改变底物的结构，如增大亲水底物的疏水性使之易溶入有机相或是将其吸附在支撑物上悬浮在有机相中以增大与有机相中底物的接触机会。③采用固定化酶，使之与两相均有接触。固定化酶不仅有利于增加生物表面活性剂产率，而且通过使酶反复使用降低成本，还能适应于连续化生产过程。

使用根霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶等可生产甘油单酯，选用胰脂酶和放线菌磷脂酶可生产磷脂。糖脂亦是酶促反应生产的生物表面活性剂中的一大类，由假丝酵母、毛霉、青霉、曲霉、紫色杆菌、假单胞菌的脂肪酶、胰脂酶，甚至由枯草生产的一种脂肽subtilisin(证实是一种蛋白酶)可生产不同的糖脂:葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、海藻糖酯等;胰脂酶、紫色杆菌、假单孢菌、根霉、毛霉等可生产山梨醇、失水山梨醇、核糖醇、木糖醇脂等;杏仁β-葡萄糖苷酶和曲霉β-葡萄糖苷酶能生产糖苷。由毛霉、根霉及假单胞菌脂肪酶生产的含氨基酸类脂有:酰基赖氨酸、酰基-β-内氨酸、酰基谷氨酸、1-O-(氨基酰基)-3-O-肉豆蔻酰甘油、O-酰基高丝氨酸等。

3.生物表面活性剂的分离

在发酵液中生物表面活性剂往往浓度低且具亲水亲油性质，因此，生物表面活性剂的分离、提取和浓缩难度较大，成为生物表面活性剂生产成本的主要组成，通常占产品总生产成本的60%～70%，因此选择合适的产物提取方法是保证生化生产工艺成功的一个十分重要的环节。经典的提取方法，如溶剂萃取、沉淀、结晶等经常被采用，静置、浮选、离心、旋转真空过滤等手段则可用于除去细胞质。静置和浮选操作虽价廉，但不适合用于细菌细胞;离心虽有效，但一次性投资和操作费用均较高，而且高速离心时发热现象明显，有时会破坏产物。过滤方法往往要借助助滤剂如活性炭、黏土、硅藻土等才能进行，以防造成滤孔堵塞。与连续式生产配套的产物提取技术有泡沫分离、离子交换等。如提取Surfactin时，先用泡沫分离法分出产物，然后消泡，再经沉淀和溶剂抽提。鼠李糖脂提取是通过树脂吸附，再经离子交换色谱提纯，将液体蒸发和冷冻干燥可得纯度为90%的成品，收率达60%。超滤是应用于生物表面活性剂提取得一种新方法，如用截留分子量为50000U的超滤膜(XM-50)提取Surfactin，可得97%纯度的产品。鼠李糖脂用超滤膜分离时，采用10000U的膜(YM-10)收率92%，采用30000U的膜(YM-30)，收率80%，而用50000U的膜(XM-50)则收率仅有58.9%。切面流过滤是另一种在线分离新方法，生物表面活性剂留在滤液中并经冷冻干燥回收，细胞和底物烃回到发酵罐中再次利用。