-插入突变体纯合体的鉴定

实验十一　T-DNA插入突变体纯合体的鉴定

【实验目的】

1.熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法。

2.掌握利用PCR方法鉴定T-DNA插入突变体的方法。

【实验原理】

“三引物法”的原理如图1-7所示，即采用三个引物(LP、RP、LB)进行PCR扩增。野生型植株(wild type，WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp(即从LP到RP)。纯合突变体植株(homozygous lines，HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与RP(或LP，根据TDNA在基因上插入的方向选择)为引物进行扩增的产物，分子量约410+ Nbp(即从LP或RP到T-DNA插入位点的片段，长度为300+Nbp。再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp)。杂合突变体植株(heterozygous lines，HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+Nbp和900bp两种产物。电泳结果差异明显(如图1-7所示)，能有效区分不同基因型的植株。此法的优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。

T-DNA序列上的引物如下。基因上的引物设计可以通过拟南芥网站http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+Nbp。

LB-Left border primer of the T-DNA insertion:

N:实际插入位点与侧翼序列之间的距离，一般为0～300bp; MaxN: TDNA在基因组上实际插入位点的最大范围，一般在300bp左右; pZone:用于设计引物RP和LP的合适区域，一般在100bp左右; Ext5，Ext3:指的是在MaxN和pZone之间的区域，该区域不适合设计鉴定引物RP和LP; LP:左侧鉴定引物; RP:右侧鉴定引物; BP: T-DNA边缘的引物; LB: T-DNA左侧边缘引物。

图1-7　“三引物法”鉴定T-DNA插入突变体的原理

(引自: http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html)

＞LBb1 of pBIN-pROK2 for SALK lines: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT＞LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG

注:上述的引物仅限于来源于SALK公司的T-DNA插入突变体植株的鉴定。

【实验材料】

拟南芥T-DNA插入突变体植株和野生型植株。

【实验器材】

台式离心机、移液枪、研钵、1.5m l离心管、PCR仪、电泳仪、DNA电泳槽、凝胶紫外分析仪等。

【药品试剂】

提取缓冲液: 200mmol/L Tris-Cl(pH 7.5); 250mmol/L NaCl; 25mmol/L EDTA; 0.5% SDS; 70%乙醇;异丙醇; 10 mmol/L Tris-EDTA缓冲液(TE);灭菌水; DNA聚合酶(Taqase)及缓冲液; dNTP(10mmol/L); LBa和LBb引物;基因特异引物; 50×TAE等。

【实验内容与方法】

一、植物基因组DNA快速提取

操作参照《拟南芥实验手册》(Weigel and Glazebrook，2004)。

此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增。

1.取拟南芥一片叶片，置于1.5ml离心管中，加入400μl提取缓冲液。

2.用研磨棒研磨叶片，直至缓冲液变为绿色。

3.在台式离心机上13000r/min离心5分钟。

4.离心后将上清液300μl转移至一个新的1.5ml离心管中。

5.在上清液中加入300μl异丙醇，混匀后于室温下13000r/ min，离心5分钟。

6.弃上清液后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀。

7.100μl TE溶解沉淀，将制备好的样品保存在4℃冰箱中备用。

二、PCR鉴定

1.将下列溶液加入PCR管中，具体见表1-5。

表1-5　PCR鉴定拟南芥纯合体的反应体系(30μl反应体系)

反应条件: 94℃5分钟

　　　　　30循环(94℃/1分钟，55℃/1分钟，72℃/2分钟);

　　　　　72℃延伸10分钟。

【注意事项】

反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。

2.电泳并根据电泳的结果进行分析。

【思考题】

1.简述植物基因组提取需要注意的事项。

2.PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的原理是什么?