-插入突变体的互补实验

实验十二　T-DNA插入突变体的互补实验

【实验目的】

1.了解并掌握互补实验的原理。

2.学会自主设计互补实验并完成。

【实验原理】

功能互补实验指的是通过将正常的基因转化为突变体，然后观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。

通过EMS或者T-DNA插入导致的基因功能失活，使得突变体具有异于野生型的表型，暗示失活的基因可能决定了该表型，如，某基因被T-DNA插入失活后，表现出对ABA不敏感，暗示该基因参与了ABA的信号通路。通过转基因的方法将该基因在突变体中能够正常表达，如果能够使突变体恢复对ABA的敏感性，则证明该基因的确参与了ABA信号反应，从而排除了可能是由于有其他的T-DNA插入位点造成的另外一个基因失活导致的表型。

无论是EMS诱变还是通过T-DNA插入获得的突变体都有一个问题，就是该突变体中突变失活的基因可能有多个。对于这种情况，一方面通过遗传的方法，即观察后代的分离比，确定突变体中的效应基因是一个还是多个。如:对于非配子体发育相关基因的突变体，如果是一个基因突变导致的表型，杂合体自交的后代表型会出现3∶1的分离比;如果是两个或者多个基因突变导致的表现，则杂合体自交的后代表型不符合3∶1的规律。对于配子体发育相关基因的突变体，杂合体后代的分离比则比较复杂，需要具体情况进行具体分析。另外一个常用的排除多个效应基因的方法就是通过功能互补的方法进行验证。功能互补实验是最直接、最终确证基因效应的方法。

早期的功能互补实验常用的转基因载体为过量表达载体，如pMD等。使用这类载体进行的功能互补实验实际上是将目的基因在突变体中过量表达，而且由于这类载体上的启动子大多为泛表达的组成型启动子，造成互补实验常常不能恢复到野生型的表型，而是出现了新的表现型。目前在操作互补实验时，研究者已经注意了这一问题，在构建转基因载体时，选择的是使用目的基因自身启动子加上目的基因的方法，常使用的转基因载体为pCAMBIA1300，载体图谱见图1-8所示。

图1-8　常用互补实验载体pCAMBIA1300图谱

(引自http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html#dsy585_Description)

【实验方法】

这里只列出步骤，具体的实验方案参照本书中的其他章节以及分子生物学操作手册。

1.载体的选择。

2.带有启动子序列的目的基因基因组的克隆和测序分析。

3.带有启动子序列的目的基因基因组构建到互补载体上并验证。

4.重组载体转化农杆菌。

5.带有重组质粒的农杆菌转化突变体植株。如果是烟草，由于采用叶盘转化法，获得的小苗为转基因植株，可以直接观察是否恢复表型。如果是拟南芥，由于采用花浸法进行转化，需要收获当代的种子，然后进行抗生素筛选获得转基因植株，再观察是否恢复表型。

6.转基因植株鉴定。即使是互补实验中获得的转基因植株，也需要对其进行一定的验证，如DNA水平验证是否将目的基因转入突变体植株以及mRNA水平上鉴定是否目的基因正常表达等。

【思考题】

互补实验的重要性体现在哪方面?为什么在研究基因功能的过程中需要进行互补实验?