拟南芥-插入突变体的获得和鉴定

第三节　拟南芥T-DNA插入突变体的获得和鉴定

插入突变体库的构建方法有许多种，应用较多的是T-DNA插入突变和转座子插入突变。这两种获得突变体方法的基本原理都是通过转基因的方法在植物染色体上插入一段外源DNA序列，从而造成插入位点附近基因功能的缺失或者改变。转座子的方法稳定性较差，同时工作量也比较大。T-DNA插入突变体法具有以下优势:①可以通过农杆菌进行转化;②插入植物染色体上的拷贝数低;③稳定性好;④T-DNA在基因组上的整合位点随机分布;⑤通过插入外源DNA上的标签序列，可以方便迅速地克隆突变基因。目前，T-DNA插入突变体法已被广泛应用于植物发育生物学研究领域。至今已经构建了225000多个拟南芥T-DNA插入突变体，获得了360000个T-DNA插入位点序列。水稻中也已经构建了200000个TDNA插入系。

最初的T-DNA插入突变载体，是左右边界内只包含一个选择标记基因(一般是抗性基因)的载体。在用这类载体建立的突变体库中，能得到部分基因功能缺失的突变体，但不能得到有功能冗余及致死效应的基因的突变体，也很难研究具有高度多效性的基因。

为了弥补这方面的不足，构建出了新的载体，即激活标签载体和T-DNA诱捕载体。

基因激活标签法(activation tagging)在植物发育生物学的研究中具有重要作用。1992年，Hayashi等人首次发现并将该技术应用于拟南芥基因的分离和鉴定。他们在T-DNA的右侧边缘区构建了一个携带除草剂抗性标记基因和花椰菜花叶病毒35S启动子的四聚体，将其作为增强子，通过农杆菌介导的转基因方法，随机插入拟南芥的基因组中。由于增强子的作用，在插入位点附近的基因会被激活而得到过量表达，故被称为基因激活标签法。该种方法获得的过量表达突变体为显性突变，表型在T1代就可以观察到。

T-DNA诱捕载体的基本原理是将含有已知DNA序列的T-DNA载体通过转化插入植物基因组中，使得插入位点基因的功能缺失或获得，从而造成突变，并在被诱捕序列启动子的控制下表达插入的报告基因，用于鉴定可见或者不可见的突变。该方法通过插入的报告基因的表达来研究被插入基因的表达模式，而且对致死基因也可以在杂合状态下进行研究。由于报告基因是显性的，因此对基因的检测不是通过检测突变体的表型，而是通过检测报告基因的活性，从而使得冗余基因得以标记。对于能够产生突变体表型的T-DNA插入，由于报告基因的检测很方便，使得表型和T-DNA的共分离分析变得更加简单。这种技术被称为T-DNA诱捕技术(T-DNA entrapment technique)。常用的有三种类型的诱捕技术:增强子诱捕(enhancer traping)、启动子诱捕(promoter traping)和基因诱捕(gene traping)。

增强子诱捕:增强子的特点是能够在相隔几个kb的地方起作用，通过位置效应影响外源基因的表达。在增强子诱捕载体中，显性报告基因被融合到一个最小的启动子下游。此启动子上只含有TATA box，不含有影响基因表达专业性和表达水平调控的启动子元件。当该载体的这部分整合到植物染色体上时，如果能够被基因组上的增强子激活，其上面的报告基因就会表达。如图1-3所示。

靠近T-DNA插入的基因组中的增强子; mP:最小启动子; GUS:报告基因

图1-3　增强子诱捕载体的作用机制

启动子诱捕:在启动子诱捕载体上没有最小启动子序列，即在报告基因上没有启动子。如果T-DNA插入到基因组中启动子的下游，则报告基因开始表达。如图1-4所示。

图1-4　启动子诱捕载体

:启动子; Ex:外显子; In:内含子; R:无启动子的报告基因;

SA:剪接位点; AAAAAA:多聚腺苷信号序列

图1-5　基因诱捕载体的作用机制

基因诱捕:该载体上也没有功能启动子，但有一个内含子剪接位点(splice acept or site，SA)。当T-DNA插入染色体上某个基因的外显子、内含子剪接位点时，由于SA的正确引导，可以确保与外显子序列翻译融合，避免标记基因插入内含子是被剪接的可能。如图1-5所示。