动物转基因原理及方法

第一节　动物转基因原理及方法

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰，这一技术称之为转基因技术。通俗地讲：转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其他物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。人们常说的遗传工程、基因工程和遗传转化均为转基因的同义词。

一、动物转基因基本原理

动物细胞中有着复杂的防止外源DNA入侵的机制，一般情况下，限制酶能将外源DNA切割并降解，而细胞本身合成的DNA则不被限制酶降解从而保持遗传稳定性。但是，偶然也会发生外源DNA幸免降解的情况，使动物产生小的变异。转基因技术就是利用动物这一特性，把外源基因注入细胞核而获得符合要求的转基因动物。

动物转基因主要是将外源基因转移到胚胎细胞内的染色体上，并进行整合、表达和遗传等。动物转基因技术是一项高度综合的技术，它涉及DNA重组技术、胚胎工程技术和细胞培养技术等。虽然基因导入细胞的方法有诸多种，如DEAE－葡聚糖转染法、显微注射法、病毒转染法、胚胎干细胞介导法、精子载体法、基因同源重组法、电穿孔转移法等等，这些方法各有自己的特点和优势，但在整个转基因动物生产过程中，其基本原理应该是相同的。即将外源基因或体外重组基因经体外扩增和修饰转移到动物受精卵或细胞内，使其在动物体内得以整合和表达，或将动物本身部分基因剪除或抑制，以产生新遗传特征或形状的转基因动物。并能将新的遗传信息稳定地进行世代遗传，从而获得新的转基因系或群体。

二、培育转基因动物的主要步骤

培育转基因动物的主要步骤包括：①目的基因的选择，这应视研究或生产目的而定；②将重组基因转入受精卵；③将转入了外源基因的受精卵植入同期发情的受体动物，在植入前完成整合胚胎的检测、筛选、建立ES细胞系；④对出生后基因整合、表达情况进行检测；⑤对整合、表达的转基因动物进行育种试验，建立由成功转基因个体或群体组建的转基因系。

1.目的基因的设计　在进行转基因动物研究时，首先要针对实验目的设计待转移的目的基因，如随机整合型基因或基因敲除（gene knockout）型载体基因。随机整合型基因可来自于同一基因，也可来自于不同基因，称为拼接基因或融合基因（fusion gene）。从结构上看，随机整合型基因可分为结构基因与调控序列两部分，若来源于同一基因，必须是完整的转录单位，包括5′上游启动子区和3′下游的加尾信号（poly A signal）区等，可从基因组文库中分离完整的基因。拼接基因应用更为广泛，可通过选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。进行基因剔除转基因动物研究时，首先要设计与待剔除基因的同源性的载体基因，包括正负选择标志基因。在进行基因设计时，还应考虑转基因动物的遗传背景和设计相应的检测方法，必要时设计一个报道基因（reporter gene）以便检测。

2.载体的选择　运用转基因动物研究基因表达，特别是在研究遗传性疾病和进行基因治疗时，选择合适的基因载体是十分必要的。载体主要用于未克隆基因的扩增和选择。最早用于哺乳类细胞表达载体的病毒是转化型DNA病毒，如SV40和腺病毒。这些载体的主要缺点是接受外源DNA容量太小，只能携带7～8kb的外源序列，因此这类载体不可能表达其他许多与疾病有关的功能基因。与其他载体相比，从鸟类和鼠类中获得的反转录病毒是目前应用广泛的一类很有前途的载体。这类病毒为失去致病能力但仍有感染能力的缺陷病毒，如通常使用的禽白血病病毒和罗氏肉瘤病毒。这类病毒载体能有效地把外源基因导入哺乳动物靶细胞，其整合方式在结构和功能上较稳定，功能基因插入和表达很容易。为避免反转录病毒启动子干扰和携入诱变的可能性，许多研究者还构建出一类已被剪除了自身启动子和增强子序列的反转录病毒。这类失活载体只表达由基因携带的启动子起始的载体编码序列，但这种载体因其滴度低而使应用受到限制。非整合型病毒载体，如HSV载体已引起人们极大关注，这类病毒基因组较大（150kb），它们具有比其他已知载体接受更大外源序列的能力，故能够转移和表达较大的基因。

3.背景及种系的选择　由于不同种系的动物对不同疾病的易感性不同，在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种系的问题，一般采用近亲交配的同一种系的动物。许多实验室在随机杂交背景下建立了转基因动物，同近亲交配的转基因动物相比，这一背景下产生的胚胎不但数量多，而且健康。尽管如此，随机交配下的碱基分离可能影响转基因动物的表型，降低了一个已知转基因动物的作用。

迄今为止，已相继报道了小鼠、大鼠、兔、猪、牛和羊等转基因的动物。目前，研究者均倾向于使用小鼠作转基因的动物。最初的转基因动物就是在小鼠体内完成的，已确定了小鼠的连锁图。由于人类与小鼠共享着80%的遗传物质和99%的基因，人类和小鼠基因组同源性高，对小鼠进行比较研究可以得知很多关于人类疾病和生理功能的情况，因此了解小鼠非常有助于了解人类自身。此外，小鼠易于饲养管理，生长周期短，容易获得已经定性的近交交配鼠和遗传突变体，并且易于进行快速连锁分析，其作为研究动物也较为经济实惠，故常被用作建立转基因动物模型。

4.转基因方法　进行转基因动物研究的基因转移方法有多种，如早期的畸胎癌细胞（teratocarcinoma cell，TCC）植入法、反转录病毒感染法、显微注射法，以及近几年新出现的方法如电转移法、精子载体法和ES细胞法、基因直接导入法和细胞核移植法等。其中较常用的3种方法有显微注射法、反转录病毒感染法和胚胎干细胞法。基因转移方法将在下面有关章节具体介绍。

5.转基因动物的建立　新出生的转基因动物通过点杂交、PCR和免疫印迹杂交等方法，先筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后分别在mRNA和蛋白水平上检测外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型等。进一步培育和筛选出转基因动物的纯合子，或和某些相关种系的动物杂交，从而建立某种疾病的转基因动物模型或生产特定产品的转基因动物。

三、常用的动物转基因技术

1.显微注射法　在众多转基因技术中，显微注射法因其出现早，研究深入，被推荐为一种最经典有效的方法。其创始人是Jaenisch和Mintz等，Gordon和Palmiter等先后通过此方法获得转基因动物。此方法目前应用较普遍，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。显微注射法的基本原理是将外源基因直接用显微注射器注入受精卵（雄原核）内，利用受精卵分裂繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中进行表达。这种方法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达100kb，能满足大多数需要。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，外源基因通常以多拷贝串联的形式随机整合于受体基因组中，这种异常排列可能妨碍其表达的正常调节，因而其表达水平在转基因个体间常不稳定，还易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。另外，显微注射法不能将外源基因导入发育较晚阶段的胚胎细胞；显微注射法所针对的是受精卵，对一些单胎动物或少胎动物，加之低整合率，阳性后代出现的概率很少。

这一方法的实验程序为：①准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。②受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。③基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。④胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟。⑤对幼鼠的鉴定：（i）幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交和进行PCR分析，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠，然后建立鼠系；（ii）自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针进行分子杂交，以鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性；（iii）直接自血液或组织中测量蛋白质，常用的方法有ELISA、放射免疫测定（RIA）或Western blot等，若蛋白质具备生物活性，可直接测定其生物活性。⑥可采用报告基因，对胚胎进行筛选，减少受体动物的使用数量。显微注射法简化的实验过程如图13－1所示。

图13－1　显微注射法制备转基因小鼠的程序

2.反转录病毒感染法　1974年，Jaenisch等将SV₄₀DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得小鼠体内有SV₄₀DNA整合。继之Jaenisch等又成功地用反转录病毒法制作转基因小鼠。随后，转基因鸡、转基因牛相继产生。Anthony等发现反转录病毒载体感染处于减数分裂中期（MⅡ）的卵母细胞，更有利于转基因牛的产生。反转录病毒是一类通过DNA进行复制的RNA病毒，感染宿主细胞之后，病毒基因组通过反转录成为DNA，称为前病毒DNA，其中一条前病毒DNA可整合到宿主细胞染色体中，将外源基因通过分子技术连接在病毒RNA上，通过病毒本身的增殖感染，将携带的基因转移给受体细胞，外源基因整合于宿主染色体，而在发育成熟的个体中表达。反转录病毒载体法是将目的基因重组到反转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去（图13－2）。

反转录病毒感染法的外源基因通常是单位点、单一拷贝整合，整合通常发生在反转录病毒的长末端重复区（LTR），从而保证了外源基因结构的完整性。与显微注射法相比，反转录病毒法的优点是可以在胚胎的各个时期进行整合，而且整合位置特定，不导致宿主基因组的重排；此法操作简便，无需特别的仪器设备。但是反转录病毒感染宿主时，为非同源整合，结构不稳定，调控区内会发生相互作用，整合效率较低，还要求进行细胞复制，所以反转录病毒法要求外源基因和反转录病毒有一定特殊性。不过，反转录病毒法是目前生产转基因鸡效率最高的方法，但所得转基因家畜的嵌合性很高，需要广泛的杂交，以建立转基因系。由于携带外源基因片段长度有限（通常为10kb左右），转入的基因易缺少其邻近的调控序列，基因的表达问题尚未解决。还有可能存在大量复制病毒和病毒污染问题。

图13－2　反转录病毒感染法

3.ES细胞介导法　ES细胞是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系，在饲养层细胞上或条件培养基中具有很强的增殖能力，并能保持其多能性。ES细胞介导法首先从胚泡期胚胎内的细胞群中分离和培养ES细胞［图13－3（1）］，并用外源基因进行转染，外源基因通过随机插入或同源重组的方式整合到ES细胞的基因组中。将转入外源基因的ES细胞重新导入囊胚或进行克隆，可培育转基因个体，通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物［图13－3（2）］。

图13－3　ES细胞介导的动物转基因

ES细胞介导法优点是：简单易行、整合率高，同时在将ES细胞植入胚胎前，外源基因的表达、整合和稳定能在细胞水平上选择，减少了工作量，工作周期也缩短。缺点是：许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因，给实际应用带来一定困难。

目前，ES细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。1981年，Evans等用不同培养系统从小鼠囊胚的内细胞团分离并建立了多潜能干细胞克隆系；一直到1996年，Stice和Strelchenko等获得了牛的ES细胞；1998年，Thomson等成功地分离到人的ES细胞系，在全世界范围内引起了高度重视。ES细胞被公认为是最理想的受体细胞，是转基因动物、细胞核移植、基因治疗等研究领域的一种新的试验材料，具有广泛应用前景。但ES细胞不易建株，在小鼠上应用比较成功，而在其他大动物上的应用尚处于探索阶段。

4.精子载体法　1989年，Lavitrano等将PSV2－CAT质粒与小鼠的附睾精子，在等渗溶液中共育30分钟后进行体外受精和移植，产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代，后代尾组织和肌肉组织中CAT基因表达十分可观。Rottman等对上述精子载体法进行了改进，将外源DNA用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然后人工授精取得成功。Anthony等尝试了一种新的方法，预先将小鼠的精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1分钟，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的小鼠卵母细胞，获得成功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜，更有利于转基因动物的产生。

近年来利用精子作为外源基因的载体来建立转基因动物的研究极为令人注目。其方法就是将成熟的精子与外源DNA进行预培养之后，通过受精使精子携带外源DNA进入卵细胞核中，并能表达和传代。精子携带DNA主要是通过3种途径来完成，即将外源DNA与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体转染法。将外源基因导入精子的关键是去除精液和精子表面抑制外源DNA结合的因子。经精子载体法转移的外源DNA多以附加体形式存在，不再受宿主DNA的影响，从理论上讲可通过使用组织特异性的增强子和启动子修饰转入基因的表达。因此，其在生产转基因动物方面显示出优越性和良好的前景。

精子载体法简单、方便，依靠生理受精过程中的独特作用，而被认为是转移外源基因的理想载体。到目前为止，精子载体法至少在12种动物中获得转基因后代，包括小鼠、鸡、猪、牛、家兔、绵羊和几种鱼类。但采用精子作为载体仍然存在一些局限，其中首先要解决的难题就是如何让精子携带或吸收外源DNA。由于精子膜结构的特殊性，适用于一般细胞转化的方法，如电击法、钙沉淀、超声波和反转录病毒法难以对它足够奏效。蛋白质因子和脂质体法给人们提供了一种新的思路。最近还有人提出，在传统精子载体法的基础上，辅以生精细胞显微注射授精的基因转移和输精管注射体内转染成熟精子等方法建立转基因动物。此外精子载体法的具体机制不清楚，尚待进一步了解，而且鉴于伦理问题，精子载体法还存在较大争论。

5.体细胞核移植法　1997年，世界上首例体细胞核移植克隆绵羊——Dolly的诞生，是转基因动物研究史上的又一个重大突破。继之，Wilmut研究小组用胚胎细胞作核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子Ⅸ的转基因克隆绵羊“Polly”。Alexander等用非转基因母羊与一只转基因公羊精子人工授精后怀孕40天的胎儿的成纤维细胞作为核供体，获得了3只转入抗胰蛋白酶基因的奶山羊。目前，利用体细胞核移植法已获得了转基因羊、鼠、牛、猪。体细胞核移植法首先对体细胞进行基因改造，获取转基因阳性细胞核，转移到去核的受体细胞（现都采用卵母细胞）中，最后发育成转基因动物（图13－4）。

图13－4　体细胞核移植法

与其他转基因方法相比，核移植可以提高转基因效率，对于与性别有关的性状（产蛋或产奶必须是雌性个体），可以预先选择雄性或雌性克隆，从而预定胚胎和后代的性别。该技术的另一个优点是可以实现大片段基因的转移。更重要的是，在胚胎移植前，它就筛选阳性细胞作为核供体，这样核移植产生的胚胎为阳性，最终产生的后代也是100%阳性。