第七章 分枝杆菌的铁质代谢机制
铁质是多数细菌的一种必需元素，它是细菌的重要细胞功能，诸如细胞呼吸乃至DNA复制有关酶类的辅助因子，在有氧存在的生理状况pH条件下，多以不可溶的三价铁复合物的形式存在。高等生物中的铁质多存在于与铁转运蛋白和铁储存蛋白（如运铁蛋白、乳铁蛋白、铁蛋白）相结合的溶液之中，因此在哺乳动物宿主细胞中游离铁质的水平远较细菌生存所必需者为低。铁质由于可催化Fenton反应，故可由需氧代谢的正常产物中生成毒性氧自由基，对机体有害。由于细菌铁质的这3种特性，它在传染病过程中也起决定性的作用，就病原体而言，它们必须要竞争宿主中的铁质以供其繁殖，使感染得以形成；另一方面，它们也必须调节铁的代谢，以防止能产生一系列对其有致死反应的过量铁质的存在。
分枝杆菌通过分泌高亲和力能够螯合Fe3＋的铁螯合剂（铁载体）来解决铁的增溶（solubilization）与铁质的获得问题。三价铁的铁螯合剂复合体通过一种未明的过程转运至细菌，铁质则可能是通过还原过程而释放至胞质之中。二价铁即可供细胞功能之用，包括整合至金属蛋白。铁质代谢的调节涉及细胞内铁浓度的觉察和摄入及储存的调节。这些功能的失调必将导致铁的缺乏或毒性铁质的聚集。对于分枝杆菌对铁水平变化的适应性反应及其有关机制的了解，将有助于发展干扰这些过程的新措施。铁质获得系统和毒力测定常是在铁－依赖方式下共同调节。这也进一步证实了解病原菌中铁－依赖性调节的重要性。
一、分枝杆菌对铁质存在的反应
首先在分枝杆菌中评估铁质丧失反应的实验是40余年前Ratledge等人所进行的工作，他们在缺铁培养基中生长的耻垢分枝杆菌中发现几种代谢上的改变，包括DNA－蛋白质比率、卟啉（血前体）水平以及含铁酶类［如顺乌头酸酶（aconitase）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehyrogenase）］活性降低。此外也发现水杨酸水平以及几种包括DNA聚合酶在内的酶类活性的增加。以后又进行了有关生长于低铁或高铁浓度培养基中分枝杆菌的铁－结合分子的产生、蛋白质合成中的变化和基因表达的调变等方面的研究。
（一）铁缺少反应中的铁－结合分子的产生
分枝杆菌的铁质受限制后能诱发其旨在增加铁获取的反应，其结果是铁载体的产量大增。分枝杆菌产生两种类型的铁载体，即分枝杆菌素（mycobactin）和外螯合素（exochelin）。致病性分枝杆菌很少产生分枝杆菌素，而腐物寄生性分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌和Mycobacterium neoarum则可产生分枝杆菌素和外螯合素。分枝杆菌素是一种含有水杨酸盐的铁载体，外螯合素则为肽分子。分枝杆菌素有两种烷基替代长度不同的型式，因而这两种型式在极性和溶解性上有所不同。极性低者多与细胞结合，而极性较高者（羧基分枝杆菌素）则可分泌至培养基中。分枝杆菌铁载体如同多数其他铁载体一样，是由铁－核糖体肽合成酶所合成。在耻垢分枝杆菌中已鉴定出含有外螯合素合成所必需基因的基因集团。这一基因集团中的3种基因fxb A，fxbB和fxbC，在外螯合素MS的生物合成中是必需的；fxb A编码甲酰转运酶；fxbB和fxbC编码肽合酶。位于fxb A的上游并以反方向转录的3个开放读框（ORF）编码与铁－肠杆菌素转运蛋白，大肠埃希菌Fep D，Fep G和Fep C相似的蛋白质。根据这种同源性，可以设想这些蛋白质（Fxu A，FxuB和FxuC）可作为铁外螯合素的转运蛋白。在此基因集团中的另外两个基因exi T和Fxu D的功能则不清楚。Exi T与ABC转运蛋白相似，而Fxu D则是与铁质转运有关的蛋白质家族的同源物，这些蛋白质包括铁铬受体（ferrichrome receptor），即枯草杆菌的FhuD和葡萄球菌属的Fep B蛋白（与铁主导的转运有关）。结核分枝杆菌全部基因组序列的注释鉴定出有10个基因的基因集团，其中mbt位点根据与其他系统的同源性编码分枝杆菌素和羧基分枝杆菌素核心合成中的酶类。3个肽合酶（Mbt B，Mbt E，Mbt F）；两个聚酮化合物合酶（Mbt D，Mbt C），一个转变chorismate为水杨酸的isochorismateh合酶（MbtI）一个水杨酸－A MP－连接酶（Mbt A）以及一个羟化酶（Mbt G），都是由Mbt基因所编码的。结核分枝杆菌MbtB突变株不能产生分枝杆菌素和羧基分枝杆菌素的事实，证实了这两分枝杆菌素类型是由同一生物合成途径所生成的。但是至今尚未在这一基因集团内发现有编码能区别分枝杆菌素和羧基分枝杆菌素的决定传递不同长度烷基替代酶类的基因。而且在结核分枝杆菌中也不能鉴定出这种基因的存在。
目前对于分枝杆菌何故需要有两种类型分枝杆菌素的原因尚不清楚，即需要有结合于细胞的分枝杆菌素和分泌的分枝杆菌素（致病性分枝杆菌中的羧基分枝杆菌素和腐物寄生性分枝杆菌中的羧基分枝杆菌素以及外螯合素）。一般认为，分枝杆菌素与细胞膜的结合可使其参与铁质的内在化过程，并且可以作为暂时保留铁质的分子机制，以防止在一个时期因铁质不足而金属含量突增时过量铁质的突然流入。
水杨酸是另外的一种铁－结合分子。其产生在分枝杆菌处于铁缺少的情况下增加，但其功能尚不清楚。它与铁质的亲和力低，因而排除了作为铁载体而起作用的可能性。虽水杨酸是分枝杆菌素生物合成的前体，但这并非为其唯一的作用，因为耻垢分枝杆菌的需要水杨酸的营养缺陷突变株对于水杨酸的需要并不能因为提供了分枝杆菌素、羧基分枝杆菌素或外螯合素而得到满足。此外这些突变株并需要水杨酸由三价铁载体中来完全同化铁质。
（二）对不同铁质水平反应中的蛋白质变化
当比较在低铁或高铁条件下生长的分枝杆菌中提取蛋白质的凝胶电泳程式时，可以鉴定出铁调节蛋白（IRP）。细菌胞壁中发现的IRP（铁－调节包膜蛋白或IREP）之所以受到特殊注视的原因，是因为它们与三价铁的铁载体复合体转运至细胞质的过程有关。由生长于缺铁条件下的耻垢分枝杆菌胞膜中，至少能检出5种IREP，其中包括广泛研究的分子量为29×103的IREP。这种蛋白质在体外能直接与三价铁外螯合素结合，而且针对耻垢分枝杆菌细胞多价抗血清的加入能有效地抑制三价铁外螯合素介导的铁质摄入。根据这些观察，分子量为29×103的蛋白可认为是耻垢分枝杆菌的三价铁外螯合素受体。但必须进行基因活化实验以确定其在三价铁外螯合素摄入中的作用。在低度铁质限制条件下生长的耻垢分枝杆菌中，H 2O2对于应激相关蛋白DnaK和GroEL的诱导受到抑制。但这些蛋白质在缺铁和不缺铁的细菌中都能因热休克和乙醇休克而正常诱导产生。这些观察以及缺铁细菌对H2O2更为敏感的事实，提示铁的代谢和氧化应激反应之间有密切的联系。
应用单向和双向凝胶电泳、质谱仪和序列信息在结核分枝杆菌进行研究证实，几种蛋白质的水平可因铁质的存在与否而发生变化。其中生长于低铁培养基中的细菌中常可诱生转运阳离子ATP酶、PEPCK（磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶）的分枝杆菌同源物和NADP－依赖性脱氢酶的产生。相反，在含铁高的培养基中生长的细菌中则可大量合成FurA（一种金属调节蛋白）、EF－Tu同源物和顺乌头酸酶。
（三）基因表达中的铁反应性变化
转录研究可用以检查结核分枝杆菌对低铁和高铁的反应。155ORF的转录受到生长培养基中铁质水平的调节。铁的缺少能诱生这些基因的2/3，而其余的1/3则受到富含铁质的上调。低铁条件下诱生的基因，其功能有半数不明。其余的则可区分为两部功能组；反应的一部集中于通过增加铁质的摄入来弥补铁的不足。例如，铁载体生物合成基因以及几种转运蛋白均因铁的不足而上调。反应的另一部分则调节细胞的一般代谢，以适应由铁的限制所致的攻击。显然，分枝杆菌素在维持由含铁辅因子所决定的重要过程，如电子传递、能量代谢和DNA合成上是必需的。与铁－硫集团装配有关基因（nifS和nifU）和编码血素生物合成蛋白（Rv0693）基因的诱导，都提示细菌可利用现有的铁质以合成这些必需的辅因子和装配一些不可缺少的含铁蛋白质。与此同时尚可诱导组氨酸和半胱氨酸生物合成途径中的基因（hisI和cysH），这两种氨基酸是血性和非血性含铁蛋白质的金属结合中心。此外也可诱导编码主要含铁蛋白质、核糖核苷酸还原酶和细胞色素P－450（Rv0766c）的基因。编码果糖磷酸激酶基因pfkA的诱导是糖酵解过程中最为重要的控制点，其诱导说明了铁缺乏时糖酵解的增加。这也反映了在细胞色素生物合成降低的情况下企图增加底物水平磷酸化以维持ATP产生，并有可能降低氧化磷酸化。类脂代谢也可能受到影响，因为编码与这一过程有关酶的基因也被诱导。所有的这些变化可能并非只有一种调节网络控制，因为编码转录调节蛋白的基因以及两个ó－因子。即ó－E和ó－B在铁缺乏的情况下也被上调。培养高铁培养基中的结核分枝杆菌能上调bfrA，bfrB和katG，表明在此种条件下，增加铁的储存能力和防止因过量铁质的存在而引起的氧化性损伤是很重要的。bfrA和bfrB编码两种铁储存蛋白，细菌铁蛋白和铁蛋白；katG编码触酶－过氧化物酶，后者催化过氧化氢的歧化，形成水和分子氧。KatG的诱导与捕捉过氧化氢以防止二价铁的氧化和通过Fenton反应生成氧自由基的需要是一致的。
二、细菌中的铁依赖性调节
细菌中改变铁浓度的反应是在转录水平上受到特殊的铁－依赖性调节蛋白的控制。这些调节蛋白可分为两类：Fur和DtxR家族。Fur（ferric uptake regulator）在大肠埃希菌和沙门菌属在高铁条件下不能阻抑铁载体产生和其受体的突变株细菌。Fur同源物则广泛存在于原核细胞，包括革兰阴性和革兰阳性细菌。一般Fur家族蛋白质可作为一种转录组抑蛋白而起作用，因为它们能结合Fe2＋，并能阻抑下游基因转录的铁调节性启动子上的特异序列。Fur也可通过间接方式调节一些基因的转录，这种间接作用的机制在大肠埃希菌中被证明是由于对能阻断细菌铁蛋白和铁蛋白m RN A转译的小型RN A合成的铁依赖性Fur阻抑。Fur对于幽门螺杆菌铁活化－编码铁蛋白基因（pfr）的作用是这种间接效应的另一实例。在低铁情况下Fur能与pfr启动子结合，而当铁的水平高时，它又可由此种DN A序列中解离，提示Fur由此种启动子上的铁依赖性释放能使其转录脱阻抑。Fur是一种多效调节蛋白，因为它不但可以控制铁的代谢，而且也可控制多种其他过程，如氧化应激反应、酸性耐受性、趋化作用、群游现象（swarming）、一般代谢过程以及毒素和其他毒力因子的合成。
Dtx R是白喉棒状杆菌的一种铁依赖性毒素调节蛋白。在其他的放线菌属，如链霉菌属和分枝杆菌属中都已鉴定出类似Dtx R蛋白。Dtx R和Fur之间虽无序列上的相似性，这两种蛋白质在功能上同源，因为Dtx R也可作为一种金属依赖性转录阻抑蛋白起作用。它可以调节编码铁转运系统、血性加氧酶、毒力决定因子的基因以及与保护细菌免受氧化应激作用有关的基因。属于类似Dtx R蛋白者有戈尔登链球菌（Str ptococcus gordanii）的ScaR、苍白密螺旋体的TroR、枯草杆菌的Mnt R等。枯草杆菌的Mnt R是一种双功能性的调节蛋白，因为它在高Mn条件下阻抑Mn2＋ABC转运蛋白mnt ABC，而当Mn的水平低时，则可正向调节这一蛋白质。
金属调节蛋白中的Fur和Gtx R家族成员都可在分枝杆菌中发现。结核分枝杆菌基因组序列的注释显示有两个类似Fur的蛋白质，Fur A和Fur B。以及两个Dtx R同源物，IdeR和Sir R。麻风分枝杆菌基因组序列中有编码IdeR，Fur B，Fir A和Sir R的基因。但后两者为假基因。在有些分枝杆菌，如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）和耻垢分枝杆菌中，fur A位于编码触酶－过氧化物酶基因katG的上游。Fur A在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中负向调节kat G的表达，从而调控氧化应激反应。此种效应在耻垢分枝杆菌中是非铁依赖性的。对于Fur B和Sir R的功能尚不清楚。至于IdeR则是在结构和功能上所知较多的一种金属调节蛋白，也是结核分枝杆菌铁代谢中的主要调节蛋白。
三、IdeR蛋白
IdeR可在致病性和非致病性分枝杆菌中发现，而且是Dtx R的密切相关的同源物，这两种约有230个氨基酸的蛋白质在其前180个氨基酸有90%以上的相同性。IdeR有两个二价金属的结合部位和3个不同的功能区；氨基端功能区中含有螺旋－转角－螺旋（H T H）DN A结合基序；二聚化功能区则带有多数的金属结合残基，这些残基均发现于前180个氨基酸之内，而且也是与Dtx R具有在大相似性的序列。存在于羧基端的第3个功能区位于前两功能区之间的槽状结构内，其特点是有一类似SH3（Src同源性功能区－3）折叠。提示可与其他蛋白质发生结合。在体外IdeR除了铁质以外，还可与其他二价阳离子结合，如Mn，Zn，Co，Ni和Mg。由晶体学结构得知，4个IdeR单体形成两个功能性二聚体，与以前在Dtx R中所观察者相同。当其与金属结合后。即可通过引起DN A－结合功能区的构象改变而活化蛋白质与DN A结合的能力。这种变化是由于氨基末端的氨基酸所介导的。这些氨基酸也参与与金属的结合。因而连接DN A与金属结合功能区。
（一）IdeR与铁质代谢的调节
IdeR基于其与DtxR的同源性，开始就被认为是一种三价铁依赖性的转录阻抑蛋白。以后证实IdeR能与tox启动子的DtxR－结合序列相结合，并能使白喉棒状杆菌dtxR突变株毒素的铁质调节得以恢复，这样就进一步证实这一概念的正确性。IdeR在分枝杆菌中的作用首先是在无毒力的分枝杆菌耻垢分枝杆菌中发现的。即发现IdeR的灭活能导致铁载体和水杨酸的不依赖铁的产生。外螯合素合成和转运基因启动子区域中IdeR结合位点的存在支持了IdeR作为铁载体产生阻抑蛋白的直接作用。现已证实IdeR与这些序列中的一个序列，即fxbA基因的直接上游处发现的一序列发生结合，而且fxbA的铁－依赖性阻抑蛋白也需要IdeR，因为这种基因在ideR突变株中即不再受到铁质的调节。
IdeR在分枝杆菌中是必需的，因为除非是有基因的第2个拷贝存在，或者是发生次级抑制因子突变，IdeR是不会被破坏的。抑制因子突变的本质虽不清楚，用野生型基因对IdeR突变进行互补实验证实，在结核分枝杆菌的铁代谢调节中IdeR是在所必需的。IdeR在有铁存在的情况下，能与铁载体合成（mbtA－J）和铁储存（bfrA）基因的启动子上的铁框（TTAGGTTAGGCTAAC CTAA）中19bp反向重复共有序列结合，阻抑前者而正向调节后者。IdeR突变体与其亲代和其互补菌株铁依赖性转录程式的比较结果显示，结核分枝杆菌中有1/3的铁质调节基因受到ideR的调节。IdeR除了控制与铁载体产生和铁质储存有关的基因以外，也可控制编码转运蛋白、转录调节蛋白、保守性分枝杆菌蛋白的PE/PPE家族成员和毒力决定因子MmpL－4的基因。
IdeR与Fur一样是一种多效调节蛋白，它可以控制铁的代谢以及其他一些与铁的代谢无明显关系的过程，即可负向或正向调节转录过程。在后一情况下，IdeR不同于Fur，能活化转录，其正向效应是间接性的。编码细菌铁蛋白基因bfrA的表达需要有Fe2＋－活化的IdeR与随机存在操纵子的结合。这些操纵子位于bfrA转录起始点（TSP）的100bp上游。这些IdeR结合位点缺失或ideR基因灭活都可阻止bfrA的表达。编码铁蛋白的bfrB亦可因IdeR与位与于TSP的106bp上游处的双铁框结合后而活化。由以上结果可知，IdeR可能是通过与RNA聚合酶的接触并促进其启动而活化转录过程，这种结合过程表现在bfrA和bfrB中者系发生于TSP约100bp上游处。IdeR所阻抑的启动子仅有一单个的铁框，一般重叠－10区域，而且IdeR与此序列的结合有望于阻止RNA聚合酶的进入。
细菌铁蛋白和铁蛋白通过IdeR的表达在控制细胞质中铁的含量上至关重要。细菌铁蛋白是体内生长的麻风分枝杆菌中检出最为丰富的蛋白质，也是副结核分枝杆菌的主要抗原。在确定这种铁储存蛋白在结核分枝杆菌的生理和毒力的重要性上，bfrA和bfrB的灭活是在所必需的。
总之，当细胞内铁的水平增加时，IdeR与Fe2＋结合，并且结合至铁调节基因启动子区域内的特异性序列（铁框），从而调控其转录。在此情况下，IdeR－Fe2＋复合体通过阻抑铁载体的产生上调铁质的摄入，和通过活化编码细菌铁蛋白和铁蛋白的bfrA和bfrB而使铁的储存增加。IdeR亦可在一种间接的方式下，正向调节针对氧化应激的保护。在低铁条件下不能形成IdeR－Fe2＋复合体，而且IdeR－阻抑基因转录，和使铁质储存基因不表达。
（二）IdeR与分枝杆菌中的氧化应激
氧化应激发生于异常高水平的反应性氧中间产物（ROS）的生成，从而引起DNA、蛋白质和类脂的损坏。铁质水平和氧化应激在需氧菌中密切联系，一方面铁的缺少能由于含铁酶类，如与防范氧自由基有关的超氧化物歧化酶和触酶活性的降低而引起氧化应激。另一方面细胞内游离铁质的增加则可参与Fenton反应而导致氧自由基生成增加和氧化应激。可见在许多细菌中铁质代谢的调节与氧化应激防范的调节是有联系的。Fur和类似Fur的蛋白质可以调节通过氧化应激诱导的基因。这些基因包括编码Mn2＋和Fe2＋超氧化物歧化酶（SOD）的基因、sod A和sod B编码的触酶和过氧化物酶、烷基氢过氧化物酶、8－羟基鸟嘌呤内切酶以及Sox RS和Oxy R调节蛋白的基因。
在分枝杆菌中铁质平衡稳定的控制与对氧化应激的防范也是有联系的，耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌ideR突变株对过氧化氢和超氧化物更为敏感。在耻垢分枝杆菌中，此种效应可能是触酶和主要超氧化物歧化酶，Sod A水平降低所致，因为IdeR对kat G和sod A的完全表达是在所必需的。但是这一效应并不是直接的，因为在这些基因的启动子上并无IdeR结合位点存在。在结核分枝杆菌的情况中，何故ideR的灭活能引起对氧化应激易感性增加的原因还不大清楚。IdeR突变株和其野生菌株在氧化应激防范有关基因的表达上，并未发现有任何差异。很有可能在ideR突变株中有氧化－还原反应性铁质群体的增加，而且再加上细菌铁蛋白和铁蛋白表达的减少，就可引起对氧化应激敏感性的增加。事实上空肠弯曲菌铁蛋白和铜绿假单胞菌细菌铁蛋白A对铁介导氧化应激的防范是必需的。IdeR作为氧化应激反应调节蛋白的作用与结核分枝杆菌感染巨噬细胞中检出的ideR上调是一致的。虽然这种诱导的原因尚不清楚，但这可能是细菌对巨噬细胞氧化防御机制反应的一部分。
四、铁和铁调节在感染中的作用
近年来曾致力于了解分枝杆菌对感染条件下的适应性反应，并曾用许多方法来鉴定选择性地表达于巨噬细胞内的基因。现有事实表明。在感染过程中，结核分枝杆菌处于受铁控制的条件下。例如，在体外铁缺少以及感染的巨噬细胞中都可诱导结核分枝杆菌铁载体生物合成所需的mbt B基因。MbtB突变株在铁载体产生上有缺陷，而且在已感染的巨噬细胞内复制微弱，表明在巨噬细胞感染时结核分枝杆菌是处于低铁环境中，并且需要铁载体的生物合成才能在体内生长。此外，表达突变的白喉棒状杆菌Dtx R蛋白（E175K）的结核分枝杆菌在小鼠中的增殖能力减弱，这种蛋白质在某些实验条件下可以作为一种固有性的非铁依赖性阻抑蛋白起作用。这种效应被认为是由于此突变株中铁质获取系统固有性阻抑的结果，但对此尚未获直接的证据。感染时为了维持铁质的平衡稳定，铁质代谢的调节也是在所必需的。在结核分枝杆菌感染的人类巨噬细胞中，转铁蛋白转运至分枝杆菌存在的吞噬体内，并可作为细胞内寄生细菌铁的来源。吞噬体内存在的分枝杆菌必须要诱导铁载体的合成，以便由铁蛋白中获取铁质，但是当获得足够量的铁质时，面对足够铁量的条件下，调节途径又必须起作用，以下调铁质的摄入。由感染组织中分离的分枝杆菌一般并不聚集有高水平的分枝杆菌素，表明细菌并非永久缺铁，有些生长于动物模型中的分枝杆菌病原体具有大量的细菌铁蛋白。因为IdeR在有效的氧化应激反应中是必需的。故很有可能，此种调节蛋白在结核分枝杆菌在巨噬细胞感染和肺部晚期感染时对氧化杀伤机制的抵抗力上也是很重要的。
五、结论
对环境中变化发生反应以适应的能力是所有活的个体得以生存和繁殖的一项重要特征。分枝杆菌病原体的引起疾病和在人体内长期存在的能力是适应环境改变的一种明显实例。目前已有充足的事实表明，铁质的获取对于结核分枝杆菌在感染宿主体内的生存和复制是至关重要的。但是在涉及过量铁质存在的情况下，这一金属代谢的各个方面都要受到严格地调节。对于了解这些机制方面已有了长足的进展。主要的铁质调节蛋白IdeR通过调节与这些过程有关的基因表达而调控结核分枝杆菌的铁质摄取和储存。可以期料，对于IdrR－调节基因编码蛋白质的进一步定性，将有助于对结核分枝杆菌铁质获取机制的全部了解，并为结核病的治疗提供新的途径。
（余传霖）
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