实验14 对流免疫电泳
(Counter immuno electrophoresis)
【目的】
1.掌握电泳槽、电泳仪的使用方法，加强抗原抗体反应特异性的理解。
2.了解对流免疫电泳的操作步骤、结果观察及实际应用，并在此基础上了解各类沉淀反应的特点。
【原理】
本实验是基于抗原抗体的等电点彼此不同，在通电的琼脂凝胶中抗体向负极，抗原向正极相对泳动而设计的。一般抗体(IgG)的等电点为pH5～9，血清蛋白抗原的等电点为pH4～5，在pH8.2～8.6的缓冲溶液中，抗体所带负电荷较少，正电荷较多，而且分子在直流电场中易受溶液中负电离子的吸引作用及溶液的电渗作用而向负极迁移;在同样条件下，抗原所带正电荷少，负电荷多，分子也较少，电泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动，若抗原和抗体相对应，则在两者相遇于最适比例形成白色沉淀线，此即为对流免疫电泳的阳性结果。
【材料】
1.抗原:正常人血清。
2.抗体:兔抗人血清。
3. 0.05u pH8.6巴比妥钠-盐酸缓冲液、生理盐水。
4. 1％离子琼脂板(用0.05u巴比妥钠-盐酸缓冲液配浇成)。
5.打孔器、图样板、微量加样器。
6.电泳仪、电泳槽。
【方法】
1.制备离子琼脂板，取水浴融化的1％离子琼脂4ml(根据板的大小和琼脂厚度确定琼脂体积)，缓慢倾注于琼脂板内，待冷却。
2.按图14-1样板打孔挑出孔中琼脂，孔径3mm，每组孔距3mm。
3.在正极的小孔加入已知兔抗人血清，靠近负极端小孔加入人血清，同时作生理盐水对照孔。
4.用微量加样器或毛细吸管按图14-1所示加抗原、抗体，勿溢出。
图14-1 对流免疫电泳实验打孔、加样图
5.加样完毕后，将琼脂板放入盛有0.05u pH86巴比妥钠-盐酸缓冲液的电泳槽内，抗原孔靠近负极端，用浸湿的纱布将离子琼脂板的两端与电泳槽内的缓冲液相接。
6.将电泳仪与电泳槽接通，开启后，调整电压，使端电压为30V，电流强度为6～8mA/cm，通电约1h。
【结果】
电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察阳性对照组、阴性对照组的白色沉淀线是否出现;再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为阴性血清(沉淀线如不清晰，可将琼脂板放入湿盒37℃或室温数小时。必要时可按常规洗涤、染色)。
【注意事项】
1.琼脂融化后应尽快浇板，防止琼脂冷却凝固，但温度太高也不利于浇板。
2.加样于琼脂孔中时应小心，防止加样时液体溢出与其他孔内样品相混，影响结果。
3.电泳时电压过高或电泳时间过长，琼脂易拉断，因此电压、电流不宜调得太高。
【思考题】
1.试分析哪些因素会影响电泳结果。
2.对流免疫电泳与琼脂双向扩散试验比较有何优点?
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