软骨组织工程

软骨组织中细胞成分单一，使得软骨组织工程成为较早的研究内容，目前已成功构建关节软骨、气管环状软骨、耳廓软骨、颞下颌关节软骨以及半月板软骨组织。

成熟关节软骨由于无直接的血液供应，因而损伤后自身修复能力有限，组织缺损直径超过3～4mm将难以愈合。目前临床治疗关节软骨缺损的常用方法包括：①微骨折技术；②自体骨软骨移植，又称“镶嵌成形术”；③骨膜、软骨膜移植；④自体软骨细胞移植。这些治疗方法都存在不同程度缺陷，组织工程技术为软骨的损伤修复提供了全新的治疗方法。

（一）种子细胞

1.自体软骨细胞 自体软骨细胞可由关节软骨、肋软骨、骺板软骨和鼻软骨等软骨组织分离培养获得。组织工程技术修复软骨缺损，往往需要大量的细胞，但人体软骨细胞来源有限且属增殖能力极弱的终末分化细胞，在体外培养过程中扩增能力有限，培养3代后，细胞将逐渐丧失表达Ⅱ型胶原的能力，转而表达Ⅰ、Ⅲ型胶原，蛋白多糖分泌减少，从而丧失成软骨能力，使其临床应用受到限制。

2.同种异体及异种软骨细胞 软骨组织具有独特的结构特点，软骨细胞被包埋在软骨陷窝内，软骨囊成为其天然屏障，可阻挡免疫细胞直接侵入，因此软骨组织具有抗原性弱，不易被机体免疫系统攻击和排斥反应轻等特点。大量动物实验证实，异体或异种软骨细胞可在受体内长期生存，并保持分泌基质功能。近年的动物实验及多种免疫检查证实，胚胎来源的软骨细胞比幼年或成年动物来源的软骨细胞更易形成软骨组织，胚胎软骨细胞的免疫原性也比异体成年软骨细胞低。

3.间充质干细胞 MSCs与已分化成熟的软骨细胞相比，具有更高的增殖能力，是软骨组织工程更有希望的种子细胞。MSCs既可在体外高密度条件下，依靠转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）等诱导环境的作用产生软骨细胞分化；又可在体内软骨缺损移植区，依靠新的“生理”微环境促进其软骨细胞分化。骨髓MSCs可以在同种异体皮下组织中生存一定时间，而能否在异体软骨缺损区域存活，并进而产生功能也值得深入研究。

4.胚胎干细胞 胚胎干细胞是全能干细胞，可分化为三个胚层所有类型的细胞，直接种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件，可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化。已有文献报道胚胎干细胞在BMP-2和BMP-4的作用下可促进分化为软骨细胞。但如何控制干细胞向特定类型细胞分化，分化后的种子细胞在宿主体内是否具有致瘤性等还需深入研究。

（二）生长因子的应用

软骨组织内含有多种生长因子，它们通过自分泌和旁分泌方式，共同作用于软骨细胞的分裂、生长、成熟和老化。单层培养的软骨细胞易发生去分化，使用特殊的生长因子，不仅可提高细胞的增殖能力，而且可保持细胞转入三维环境中的再分化能力。Blunk等将牛软骨细胞种植于聚羟基乙酸支架，发现胰岛素样生长因子Ⅰ、白介素4和TGF-β能促进软骨细胞合成糖胺聚糖和胶原，而血小板衍生生长因子起着相反的效应。近年，人们正尝试通过基因修饰的软骨细胞或软骨祖细胞来表达生长因子，促进新生软骨形成。

（三）细胞外基质支架

种子细胞可包埋在水凝胶等支架内，也可种植于多孔三维支架内。根据支架制作的特征，可将支架分为预制支架和可注射支架两类。体外预制支架对修复大的全层软骨缺损可能更有利；而可注射性支架在微创治疗（如关节镜手术）时可能利于操作。软骨组织工程支架材料的来源包括两大类：天然来源的材料和人工合成材料。天然材料（如胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白等）往往含有与细胞表面受体相吻合的配体，因此细胞容易黏附，同时这些材料还具有良好的生物相容性；但这些材料也存在缺陷，如难于加工、机械性能不足、质量难以控制、存在抗原性和传播病原的可能等。人工合成材料不受来源的限制，容易加工成形，可根据需要调整机械性能和降解性能，如聚羟基乙酸。孔隙率超过90%的聚羟基乙酸无纺网现已被广泛用于工程化关节软骨组织的构建中，但该支架仍存在力学性能不足，受力时易变形而导致种植细胞损伤的缺陷。聚氧化乙烯材料是目前FDA批准的医用材料之一，也是最常用于组织工程的亲水性合成水凝胶。

（四）生物反应器的应用

目前许多实验室是利用培养瓶进行种子细胞的扩增培养，设备要求低，容易开展相应工作。但存在许多缺陷，如：频繁换液增加了污染概率、浪费人力；每次换液导致细胞外微环境的骤变，影响细胞增殖；细胞在培养瓶中是二维生长方式，与体内所处的三维方式迥然不同，长期培养将导致细胞表型改变。构建工程化组织往往需要大量的种子细胞，联合应用微载体和生物反应器可以在较短时间大量扩增种子细胞，满足构建组织的需要。生物反应器既可以用于动态种植细胞，也可用于细胞-材料复合体的灌流培养，现已成功用于组织工程软骨的制备及移植研究。

（五）关节软骨缺损修复

目前工程化软骨组织修复关节软骨缺损仍主要处于动物实验阶段，临床应用尚处于起步阶段。Cherubino等用自体软骨细胞种植于双层胶原膜三维支架，修复13例踝关节和膝关节软骨缺损，平均随访6.5个月，术后患者功能状况得到改善，MRI显示修复区为透明软骨影像。Wakitani等采用随机对照的方法，用复合和不复合自体骨髓间充质干细胞的胶原凝胶，对24例膝关节骨关节炎患者进行治疗，细胞复合移植组的关节镜复查和组织学检查结果优于无细胞移植组，但两组临床症状的改善没有显著性差异。由于目前尚不能得出组织工程方法修复关节软骨缺损明显优于其他方法的结论，采用随机对照和盲法、制定合适的纳入、排除标准和评价方法等可能会更有利于对此方法的评价。