卵泡的发育与成熟

一、卵母细胞的成熟

妇女一生中所具有的卵细胞都在胚胎期形成。到胎儿5个月时初级卵母细胞有丝分裂增殖停止而开始减数分裂（成熟分裂）。此状态持续至青春期后，卵泡成熟排卵时才能完成其第1次减数分裂，排出第一极体，成为具有23条染色体的次级卵母细胞。排卵后第2次减数分裂开始，这次停留于中期，不继续分裂。若精子进入次级卵母细胞则继续分裂，并完成第2次减数分裂，排出第2极体成为卵子，此时各含有23条染色体的精子与卵子结合，成为含有46条染色体的受精卵，以后它便在输卵管运行进入宫腔，在排卵后的第7～8天附着于子宫内膜开始种植。

二、妇女一生中卵泡数目的变化

卵泡（follicle）是女性生殖的基本单位，由生殖细胞即卵子（oocytes）及其周围的内分泌细胞组成。妇女一生中卵泡只减不增，如新生女婴两侧卵巢有70万～200万个原始卵泡，到青春前期，绝大多数卵泡（平均50%～70%）在受到下丘脑、垂体及其他激素、生长因子与细胞因子的影响，卵泡在各个阶段发生退化而闭锁（follicular atresia），仅有少数能发育成排卵前卵泡。青春期时，每侧卵巢的卵泡数约8万个。35岁时，由于卵泡闭锁与排卵（ovulation）的损失，每侧卵巢只剩2万5千个到5万个卵泡。到58岁时，每侧卵巢仅剩不足1千个卵泡。卵泡闭锁后残留的组织成分分散在卵巢间质，这些内分泌细胞成为卵巢间质细胞（ovarian interstitial cells）（图3-1，图3-2）。

三、卵泡的发育成熟

目前认为卵泡（follicle）的发育成熟过程跨越的时间很长，仅从有膜的窦前卵泡发育至熟卵泡就需要85d（图3-3）。

根据卵泡形态和功能的特征可分为始基卵泡（primordial follicles）、初级卵泡（窦前卵泡，preantral follicles）、次级卵泡（窦状卵泡，antral follicles）、囊状卵泡（Graafian follicles）。

始基卵泡直径约30μm，是由一个双线期卵原细胞和周围一层扁平的前颗粒细胞组成，新生儿两侧卵巢内有100万至200万个始基卵泡。

图3-1　出生后卵泡数量的变化

图3-2　妇女一生中卵巢生殖细胞的变化

初级卵泡（primary follicle）是由始基卵泡发育而来，直径＞60μm，此期的卵母细胞增大，颗粒细胞由扁平变为立方形，但仍为单层。在此期，卵母细胞和颗粒细胞之间出现一层含糖蛋白膜，称为透明带，它是由卵母细胞和颗粒细胞共同分泌形成的。

初级卵泡进一步发育形成次级卵泡（scondary follicle），次级卵泡的直径＜120μm，它由卵母细胞和多层颗粒细胞组成，初级卵泡含有的颗粒细胞数不超过600个。

初级卵泡和次级卵泡均属于窦前卵泡（preantral follicle）。随着次级卵泡的进一步发育，卵泡周围的间质细胞生长分化形成卵泡膜，其可分为内泡膜和外泡膜层。Gougen根据卵泡膜内层细胞和颗粒细胞的生长，将有膜卵泡的生长分为8个等级。具体分级如下。

图3-3　卵泡发育

1级卵泡正值黄体期，颗粒细胞增殖，周围由卵泡膜细胞包围并增殖，1级卵泡仍属于窦前卵泡，约25d后在第2个月经周期的卵泡期发育为第2级，此时颗粒细胞间聚集的卵泡液增加融合成卵泡腔，故卵泡也称为窦腔卵泡（antral follicle），从此以后的卵泡均为窦腔卵泡。20d后在黄体期末转入第3级，15d后转入第4级，其卵泡直径约为2mm。10d后在第3个月经周期的黄体晚期转入第5级。第5级卵泡为卵泡募集的对象，被募集的卵泡从此进入6级、7级、8级，每级之间间隔5d。在第4个月经周期的第5～7天后一般只有一个卵泡发育，此卵泡称为优势卵泡（dominant follicle）。

目前，认为优势卵泡的选择与雌激素的反馈调节有关，优势卵泡分泌雌激素的能力强，其卵泡液中的雌激素水平高。一方面雌激素能在卵泡局部协同卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）对颗粒细胞的作用，提高卵泡对FSH的敏感性。另一方面，雌激素对垂体FSH分泌具有负反馈抑制作用，使循环中的FSH水平下降。卵泡早、中期，随着卵泡的发育和雌激素分泌的增加，垂体FSH的分泌减少。优势卵泡分泌雌激素的能力增强，对FSH较敏感，其生长对FSH的依赖较少，可继续发育成成熟卵泡（图3-4）。其他卵泡分泌雌激素的能力差，卵泡液中的雌激素水平低，卵泡对FSH的敏感性较差，其生长发育依赖较高水平的FSH，FSH水平下降时它们闭锁。卵巢内大部分卵泡不能发育成为成熟卵泡，它们在卵泡发育成熟的各个阶段退化、闭锁。

图3-4　成熟卵泡和卵泡壁的结构
1.表皮；2.被膜；3.卵泡膜外层；4.卵泡膜内层；5.毛细血管；6.颗粒细胞；7.卵子；8.卵泡液；9.卵巢间质

成熟卵泡也称为Graafian卵泡（Graafian follicle），成熟卵泡的直径可达20mm以上，分泌雌激素能力增强。成熟卵泡破裂，卵母细胞从卵巢排出，该过程称为排卵。排卵发生在卵泡期，此时雌二醇水平迅速上升达到峰值，该峰值水平可达到350pg/ml以上，雌二醇对中枢产生正反馈，诱发垂体LH的峰值分泌，形成LH峰。LH峰诱发排卵，排卵发生在LH峰后约36h。

四、卵泡发育成熟的调节

研究证明，卵泡的生长发育主要靠促性腺激素的刺激，即使是发育后期的卵泡也需要它的作用。除此之外，卵巢局部产生的其他诸多因子如甾体激素和卵巢多肽也参与卵泡的发育成熟过程。

1.促卵泡激素 由于前一周期黄体的萎缩，雌激素对黄体的负反馈得以解除，垂体释放的FSH增加是触发新的卵泡发育的主要因素。一个5mm大小的卵泡需要FSH的持续刺激才能发育成为直径≥20mm的排卵前卵泡，此时颗粒细胞数目增加5～6倍，达到5000万个左右。FSH具有以下生理作用：直接刺激颗粒细胞增殖和分化；诱导颗粒细胞FSH和LH受体合成，提高颗粒细胞对LH的反应性，以保持排卵前卵泡的甾体合成和排卵后黄体的形成；FSH可与颗粒细胞表面的受体结合，激活腺苷酸环化酶和c AMP依赖性蛋白激酶诱导基因产物的表达，如芳香化酶活性增强，使更多的雄激素转化为雌激素；FSH还能刺激抑制素（inhibin）、激活素（activin）和胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）等的合成，这些多肽类物质在调节优势卵泡的选择和闭锁方面起重要的作用。

2.黄体生成素 黄体生成素（luteinizing hormone，LH）在排卵前卵泡的甾体激素合成中起关键作用。在卵泡发育的后半期，虽然垂体释放FSH减少，但其释放LH的脉冲频率增加，卵泡颗粒细胞LH受体合成也增加，因此卵泡分泌的雌激素增加。卵泡膜细胞和间质细胞也有LH受体，在整个月经周期中LH直接作用于这些细胞调节其合成甾体激素，排卵期垂体释放的LH，一方面终止颗粒细胞的增殖，使雌激素的分泌暂时受到抑制；另一方面可通过一系列的连锁反应，诱发卵泡破裂和黄体形成。

3.甾体激素

（1）雌二醇：雌二醇（estradiol，E2）在卵泡发育过程中起重要作用。卵泡期雌二醇缓慢升高，此时高水平的雌二醇可抑制促性腺激素的释放，使血浆FSH水平降低，这时低水平的FSH是选择优势卵泡的重要决定因素之一。动物实验证明，雌二醇能使颗粒细胞增殖，其上的FSH和雌二醇受体增加，从而增加卵泡对促性腺激素的反应性；此外，雌二醇还可以增强芳香化过程，使雌二醇本身合成增加。

（2）雄激素：在LH的刺激下，卵泡膜细胞可产生雄激素（androgen），其中以睾酮（testosterone）最为重要。这种激素前体可以穿过卵泡膜细胞膜达到颗粒细胞，并在FSH的作用下转化为雌二醇。在FSH供给不足的情况下，睾酮不能全部转化为雌激素，剩余的睾酮就被转化为高活性的双氢睾酮，可抑制雌激素对颗粒细胞的促增殖作用，导致卵泡发生闭锁。

4.多肽类

（1）表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）：是一种含53个氨基酸的多肽（polypeptide），分子量为6000，存在于机体许多器官和组织，包括生殖道中，体内外实验均证明，EGF是雌激素作用的中介体（mediator），具有很强的促细胞分裂作用，可刺激多种细胞增殖。

（2）转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）：在结构和功能上与EGF相似，并作用于同一受体。体内合成的往往是TGF-α的前体，在细胞表面的蛋白酶作用下被激活为TGF-α。免疫细胞化学证明，卵泡膜内层细胞可产生TGF-α，并作用于颗粒细胞上的EGF/TGF-α受体，促进颗粒细胞增殖，干扰FSH诱导的细胞分化。现已证明TGF-α/EGF参与了卵巢的旁分泌调节，起到调节颗粒细胞对FSH的反应性，增强细胞增殖和抑制甾体激素合成的作用。

（3）胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）：是小分子单链多肽，分子量为7000，与胰岛素前体（proinsulin）的结构很相似。人类卵泡膜细胞和颗粒细胞均可合成IGFs。卵泡膜细胞合成的是IGF-Ⅰ，而颗粒细胞合成的是IGF-Ⅱ，并可释放入卵泡液中。体外实验证明，一些可刺激颗粒细胞增殖的药物如FSH及人绒毛膜促性腺激素或双丁酰环磷腺苷，均可诱导IGF-ⅡmRNA的表达，提示IGF-Ⅱ可能起自分泌调节作用，刺激颗粒细胞的增殖。颗粒细胞合成的IGF-结合蛋白（IGF-binding proteins，IGFBPs）可调节该细胞对IGF的局部反应性。卵泡膜细胞不仅合成IGF-Ⅰ，还合成IGF-Ⅰ受体。胰岛素或IGF-Ⅰ可刺激体外培养的卵泡膜细胞或间质细胞合成雄激素。

（4）纤维母细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）：是一种肝素结合性蛋白（heparin-binding protein），在胚胎的性腺和成年人的卵巢均可合成。FGF已被认为卵巢发育和黄体生成的血管生长因子。同时，它还能作用于颗粒细胞，以改变其甾体激素合成能力，刺激促性腺激素受体和纤溶酶原激活物的合成。

（5）血小板和血管内皮生长因子：血小板生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是由两条多肽链，即A链（17 000）和B链（16 000）通过二硫键形成的聚合物，具有促进细胞进入生长周期的作用。能增强颗粒细胞对FSH诱导的反应性，使孕酮分泌，并使腺苷酸环化酶、纤溶酶原激活物和LH受体合成增加。通过免疫细胞化学技术发现，卵巢间质细胞、颗粒细胞和着床前后的胚胎都可合成PDGF和受体，提示它可能与卵泡和胚胎发育有关。在卵巢组织中可检出一种与PDGF结构上相似的多肽类物质称血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），血管内皮生长因子在黄体组织中的含量尤高，具有促进卵泡血管生长的作用。

（6）卵泡抑制素和激活素：20世纪80年代中期，Ling等从猪卵泡液中分离出一种分子量32 000的蛋白质，根据其在体外对垂体细胞释放FSH起抑制或刺激作用而分别被称为抑制素（inhibin）或激活素（activin）。抑制素由α和β两个亚单位组成，而激活素则由抑制素中的两个β亚单位组成。给予体外培养的卵泡膜细胞以基因重组激活素，可显著地抑制其黄体生成素（LH）和胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）诱导的雄激素合成。相反，微量的抑制素则可显著地增强LH/IGF诱导的雄激素合成，提示抑制素和激活素可能参与调节卵泡膜细胞的甾体合成过程。同时，激活素可增强FSH对未成熟颗粒细胞孕酮合成的诱导作用，而削弱FSH对成熟颗粒细胞孕酮合成的诱导作用，提示它们可能又是有效的雄激素芳香化酶芳香化自分泌调节物。最近通过基因剔除（gene knockout）技术发现体内缺失抑制素基因的小鼠会发生卵巢间质肿瘤，提示抑制素可能也是卵巢肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）之一。

（7）卵泡成熟抑制素（follistatin）：是一种糖蛋白。已发现至少有3种分子量不同（32 000，35 000和39 000）的形式存在。卵泡成熟抑制素由颗粒细胞合成，其释放受FSH的调节。在体外，卵泡成熟抑制素有抑制垂体细胞释放FSH的能力，但其效力仅为抑制素的10%～30%。最近的研究表明，卵泡成熟抑制素也是一种激活素结合蛋白（ac-tivin-binding protein），在体外阻止激活素的作用。

（8）白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）：在卵巢中可观察到许多非性腺成分如单核巨噬细胞和多核粒细胞存在，常位于卵泡毛细血管周围。这些巨噬细胞被激活后可产生一些细胞因子如IL-1，在体外有对抗促性腺激素的作用。由于白细胞介素-1又是炎性介质，所以它还可能参与卵泡的发育和排卵过程。

（9）肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）：是一种157个氨基酸的多肽，具有引起肿瘤坏死作用并参与各种细胞分化的过程。它也可由卵巢内巨噬细胞合成并作用于颗粒细胞、卵泡膜细胞和间质细胞，通过选择性地抑制合成甾体激素的关键酶，从而抑制促性腺激素诱导的孕激素和雄激素的合成。

五、卵泡液

卵泡液的形成和卵泡呈囊状是卵泡发育成熟的重要标志。卵泡液由血浆渗出物和卵巢局部的分泌物如氨基多糖（glucosaminoglycans，GAGs）和甾体激素等组成。由于卵巢血管并未穿过卵泡基膜，所以卵泡液直接提供了颗粒细胞和卵子的生存环境；同时卵泡液的成分反映卵泡激素合成的情况以及卵子成熟、排卵和黄体化等过程。

1.卵泡液的理化特性 卵泡液呈淡黄色，黏稠，p H低于血浆和血清，主要受二氧化碳分压调控。卵泡液的渗透压接近或低于血浆，其电解质浓度如钠、镁、铜、氯和无机盐则与血浆相似。卵泡液钾离子浓度比血清高，可能与闭锁卵泡的颗粒细胞降解所释放的钾有关。

2.卵泡液的成分与功能

（1）蛋白质：卵泡液的蛋白质含量较血浆低，主要来源于卵泡细胞的分泌和血浆成分，约88%的血浆蛋白可通过卵泡壁扩散到卵泡腔中。不同大小的蛋白质在卵泡液中的浓度不同。一般来说，卵泡液中蛋白质含量与其分子量呈倒数关系，即分子量越大的蛋白在卵泡液中的浓度越低，提示卵泡膜具有分子筛（molecular sieve）的作用。显然，在闭锁卵泡和囊状卵泡中，由于卵泡膜的分子筛功能受损，卵泡液内含有较高浓度的大分子蛋白质。卵泡液中蛋白质包括许多酶，如胶原酶（collagenase）、纤溶酶原激活物（plasminogen activator）和抑制物（plasminogen inhibitor）等。这些酶不仅参与卵泡破裂过程，而且可防止血液局部凝固，有利于卵子释放。最近，从卵泡中检测出一种丝氨酸蛋白酶抑制物，即蛋白C抑制物（protein C inhibitor，PCI），分子量为57 000，浓度为8.0μg/ml，较血浆中的浓度（0.5μg/ml）稍高。通过检测小鼠PCImRNA，证实卵巢局部可合成PCI。PCI能抑制多种丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶（trypsin），血栓素（throbin）、血管舒缓素（kallikrein）、组织纤溶酶原激活物（t PA）和尿激酶（uPA）等，推测PCI可能参与调节卵子成熟和卵泡破裂的过程。此外，通过免疫组织细胞学技术发现，PCI存在精子顶体膜上，尤其是破损的部位，而且PCI在体外可以抑制顶体素的蛋白活性，可能参与保护精子不被自动激活的顶体素消化的作用。PCI还可抑制小鼠体外受精过程，但在人类生殖过程中的作用尚待进一步研究。

（2）蛋白多糖和氨基多糖：蛋白多糖（proteoglycans）是一种糖蛋白，其糖链多为长链氨基多糖。许多长链连接在一个蛋白核心上，因此，其含糖量比蛋白多糖多，故称为糖蛋白。氨基多糖（glycosaminoglycans，GAGs）是由数个双糖组成，每一个双糖含有一个氨基乙糖（aminohexose），常为D-葡萄糖胺或D-乳糖胺，至少两个双糖中的一个含有酸性化合物和硫化物，使其称为高度带负电的离子，并将正电离子和水藏在分子分子的内部。因此，氨基多糖的作用是使组织具有弹性和液体黏稠性，并稳定细胞基质。在卵泡液中发现的氨基多糖分子量常为750 000～2 500 000，这么大的分子是无法通过血液-卵泡屏障的，因此只能留在卵泡内。在哺乳类卵泡液中的氨基多糖主要是硫酸软骨素（chondroitin sulfate）和硫酸类肝素（heperansulfate）。这两种黏多糖（mucopolysaccharide）比例的变化可能影响卵泡液的黏稠性。已知随着排卵期的临近，卵泡液的黏稠性增加。

（3）促性腺激素和催乳素：卵泡液中的促性腺激素（gonadotropin，Gn）随着卵泡的大小、发育阶段和月经周期的变化，卵泡液中Gn可以反映血液循环中的激素水平。卵泡液中的FSH和LH分别不超过血浆水平的60%和30%，随着卵泡的生长、其中FSH和LH的水平不断增高，但LH和FSH升高得更慢，因此不是在所有的卵泡中都能测到LH，而是在大卵泡中才能检出。然而，对于催乳素来说，各个发育阶段的卵泡液中均可测出它的存在，尽管其含量差异很大，为血浆的8%～180%，一般在小卵泡中含量较高，随着卵泡的发育，其含量会降低。

（4）类固醇激素：在囊状卵泡中类固醇激素（steroids）的合成功能相当活跃，因此某些激素的水平可比血浆高出40 000～100 000倍。已知，卵泡液中的激素包括孕激素、雄激素和雌激素，其中雄激素/雌激素比值是检测卵泡活力和预示排卵的重要指标之一。一般来说，大多数卵泡中雄激素含量高于雌激素，仅少数几个卵泡（优势卵泡）的卵泡液中雌激素水平才高于雄激素，而且也只有这些卵泡才能继续发育成熟。