毛细管电泳进样及富集

毛细管的内径十分狭小，所需样品区带不过数纳升，色谱分析中常用的进样方法有较大的死体积，会使分离效率下降，因此并不适用于毛细管电泳。通常将毛细管与样品直接接触，依靠电迁移或流体力学来驱动样品。

1.电迁移进样

电迁移进样是在电场作用下，依靠样品离子的电迁移和(或)电渗流将样品注入毛细管。电迁移法对毛细管内的填充介质没有特别的限制，属于普遍适用性方法，可以实现全自动化操作，是商品仪器常用的进样方法。但是电迁移法会产生电歧视现象，即有效电泳速度大者多进，速度小的则少进或不进，因此会降低分析的准确性和可靠性，此法尤其适用于黏度大的缓冲液和毛细管凝胶电泳。

2.流体力学进样

流体力学进样也是普适方法，主要通过扩散、压力等进样方法来实现。扩散进样是将毛细管插入样品溶液时，样品分子因毛细管口处存在浓度差而向管内扩散，扩散进样动力不可控，因此进样量仅由扩散时间决定。由于扩散的双向性，扩散进样可以得到畸变程度较小的初始区带，提高分离效率。但是扩散进样选择性差，样品及其背景同时被引入毛细管，对后续分离可能产生影响。进样时间也会影响分离效果，进样时间过短，峰面积太小，分析误差大;进样时间过长，样品超载，进样区带扩散，会引起峰之间的重叠，分离效果变差。扩散时间通常控制在10～60 s。

压力进样也称流动进样，它要求毛细管的填充介质具有流动性，当毛细管两端置于不同压力环境时，通过管中溶液的流动，将样品带入。压力差是进样动力，可以通过在进样端加压或检测器端抽真空等方法来实现。检测器端抽压进样对仪器的要求高，并且容易出现泄漏导致进样不重复，而利用压缩空气瓶可以方便的实现加压进样，并能和毛细管清洗系统共享，因此在商品化仪器中广泛使用。与扩散进样一样，压力进样也没有偏向问题，但是选择性较差，样品中的背景干扰也会被引入毛细管，这可能会给后续分离带来影响。

进样方法的选择比较简单，电动进样存在歧视问题，因此定量分析时应尽量避免使用电动进样。压力进样只适用于有溶液的电泳模式。毛细管内径细，相应的检测体积一般为液相色谱的1/100，因此在最常用的紫外检测器中灵敏度不高。目前解决方法有3种:①改进流通池如采用“Z”形池或泡状池等增加检测窗口的宽度;②采用高灵敏的检测器如激光诱导荧光检测器、质谱检测器等;③对样品进行预处理或预浓缩然后对分析物进行电泳分离分析。

尽管进样方法的选择比较简单，但是如何选合适样品预处理或预浓缩技术是提高被分析物检测灵敏度和分离效率的有效方法之一，也是难点之一。样品前处理技术或预浓缩技术可以提高样品通量或将痕量分析物进行预富集，去除样品基质。将其与毛细管电泳技术联用不仅可以提高分析的灵敏度，同时也消除了大部分可能的基质干扰，是一种比较理想的富集分离手段。常用的样品预处理方法有流动注射、固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、微透析、膜萃取等与CE的联用技术，这些方法原理与色谱中的样品前处理技术相同，这里就不再详细介绍了。目前常用的样品在线预浓缩或富集技术主要包括以下几类。

(1)场放大样品富集(field－amplified sample stacking，FASS)。场放大样品富集是经典且操作最为简便的聚焦模式。它采用高电导率的电泳缓冲液和低电导率的样品溶液，当低导和高导溶液同时存在于毛细管中并被施以电压时，低导区的电场较高导区的强，样品离子在低导区的迁移速度比在高导区快。当样品离子穿越低导区域和背景缓冲溶液的边界时，样品离子的迁移速度骤降从而导致了样品区带长度的缩短，样品的浓度相应地提高，从而达到了富集的目的。FASS是毛细管电泳中应用最广泛的在线富集方法之一，FASS进样方法有压力进样和电动进样，压力进样在电泳初期产生聚焦现象，聚焦时间很短，检测灵敏度的提高有限，因此多采用电动进样。FASS中电渗流会使毛细管中形成不均一的局部梯度，导致聚焦样品弥散，同时，进样体积过大也会降低分离度和聚焦效率，因此FASS进样量一般不超过毛细管总体积的5%。针对FASS技术中进样体积小的问题，Chien与Burgi发展了大体积样品富集(large－volume sample stacking，LVSS)技术。其原理为在毛细管中先进一段较长的样品塞，然后改变实验条件除去样品基体，并使被分析离子堆积在进样端。Lin等利用LVSS联用胶束扫集(sweeping)毛细管电泳富集并检测血浆中卡马西平及其5种代谢产物，血浆样品经乙酸乙酯提取后冷冻干燥，复溶于含有5%甲醇的5 mM磷酸盐(pH 3.5)低浓度缓冲液中。胶束扫集电动色谱高浓度缓冲体系含150 mM磷酸盐(pH 3.5)，50 mM十二烷基磺酸钠(SDS)，15%甲醇(v/v)，检测波长为214 nm，毛细管柱依次采用1 M盐酸、水及高浓度缓冲体系冲冼5min，大体积压力进样10 psi×20 s，采用20 kV进行分离，SDS和样品离子间的高亲和力会使样品区带缩短，与此同时，卡马西平及其代谢产物会在低浓度和高浓度缓冲液区之间的边界减速，形成一个狭窄的样本区，达到双重富集的效果。与未经LVSS富集的MEKC相比，该联合富集方法可以提高约300倍的灵敏度。

(2)pH富集法(pH stacking)。常见的pH富集法包括pH调制富集(pH mediated stacking)和动态pH界面富集(dynamic pH junction stacking)。pH调制富集根据待分析物离子带电性质不同可分为酸富集和碱富集2种。它以高离子强度的弱酸盐或弱碱盐为电泳缓冲液并通过电迁移引入毛细管，然后通过电迁移引入一小段强酸或强碱溶液，强酸或强碱中在电动进样时快速地向样品区带迁移，中和其中的弱酸盐或弱碱盐，使待测组分变为电中性，导致电中性样品区带的电导率大大降低，待测组分在样品区带与背景缓冲溶液的界面处进行堆积，样品区带缩短，样品浓度增加，从而使灵敏度显著提高。由于pH调制富集无需对样品进行除盐、稀释等前处理过程，因而简单方便，对药物及代谢物等的分析具有很大的优势。Yu等采用pH调制富集结合CE－MS检测了乳腺癌患者尿液中的22种氨基酸及2种有机酸，灵敏度可以提高4～7倍。李云等用场放大进样和酸富集结合的大体积样品复合富集方法，实现了毛细管电泳对高盐样品中阳离子的有效富集和分离。向样品溶液中添加70%(V/V)乙腈，场放大进样600 s后，电动注入强酸进行酸富集，预富集样品带用毛细管区带电泳分离仍能获得满意的分离度。此法的富集倍数约为常规电动进样的800倍。

动态pH界面富集(dynamic pH junction stacking)是另一种操作简便、应用广泛的pH聚焦技术。它是利用两性物质、弱酸或弱碱等在不同pH条件下带电状态不同，经过pH突变界面时，因解离速度变化而发生迁移速度或迁移方向的突变，使被分析物聚集到一个很窄的区域，达到富集的效果。Chalcraft等利用动态pH界面产生核苷迁移速度差异实现样品富集。该实验中，pKa值、邻二醇和硼酸盐的络合是产生聚焦的关键因素，因此可以通过调整样品和背景电解质的pH及硼酸盐的浓度来优化聚焦效果。并且该方法允许大体积样品注射，最大进样体积约300 nL。此富集方法对核苷的分析可以将浓度灵敏度至少提高50倍，检测限可以达到4.0×10－8 M。

(3)等速电泳富集法(isotachophoresis stacking)又称“移动边界”电泳技术，是基于离子淌度差异的一种电泳富集模式。它是将样品注入带同种电荷但电泳淌度分别比待分析物高和低的电解质置于样品区带的前端(前导离子)和后端(后置离子)。在外加电场下，随着样品中各组分的分离，每个样品组分区带的电场在发生变化。电泳迁移速率大的离子，电导较大，区带的电场较小，其迁移速率就降低。待分析离子在样品与前导电解质边界上速度减慢而堆积，而后置电解质会压缩样品区带，达到稳态后，3个区带紧密相连，最终以相同速度运动。等速电泳是一种较理想的样品富集技术，它对痕量样品起到浓缩的作用，而对样品中的基体成分则起稀释作用。此外，它的负载量比较大，进样量可达μL级别。Ren等比较了等速电泳分别与MEKC和CEZ联用检测尿液中3－硝基－酪氨酸。以尿液中的氯化物作为先导离子，pH 8.2的HEPES－Tris缓冲液为后置离子和分离缓冲液。结果表明，与MECK联用时等速电泳显示了较好的富集效果和峰效率。采用等速电泳富集样品时，为了产生较好的富集效果，需要对前导和后置离子进行选择和优化。Jung等考察了初始样品离子浓度、前导离子和后置离子的浓度等参数对等速电泳聚焦效果的影响。发现浓缩样品离子的浓度与前导离子的浓度成正比，而后置离子浓度降低会增强电场强度，从而提高样品堆积的速率。

毛细管电泳在线富集技术取得了许多重要的进展，还有许多富集及样品处理技术不断涌现。如何根据样品的性质选择合适的样品处理及富集技术，实现多种在线聚焦技术联用，从而提高检测灵敏度，是我们在实验中需要重点考察的问题。